[發明專利]用于造血細胞體外培養的生物反應器系統

無效

• 申請號: 200710044747.7
• 申請日: 2007-08-09
• 公開（公告）號: CN101130745A
• 公開（公告）日: 2008-02-27
• 發明（設計）人: 蔡海波;周美琴;華平;譚文松
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12M3/00
• 代理公司: 上海光華專利事務所
• 代理人: 余明偉

技術領域

本發明涉及一種生物反應器系統，具體地說涉及一種用于造血細胞體外培養的生物反應器系統。

背景技術

造血干細胞是一種具有高度的自我更新和多向分化能力的成體干細胞。造血干細胞移植已被廣泛應用于惡性血液病、非惡性難治性血液病、遺傳性疾病和某些實體瘤的治療。還可以通過細胞因子誘導造血干細胞向紅系、粒系和巨核細胞/血小板分化，用于成分輸血和治療腫瘤放療、化療所致的中性粒細胞和血小板減少等癥。臍血是優良的造血干細胞來源，具有來源豐富，采集方便；造血干細胞含量豐富，原始干/祖細胞比例高；免疫排斥性低；對供體無傷害等優點，在臨床上日益受到關注。但每份臍血的造血干細胞數量有限，單份臍血僅能滿足較低體重兒童的移植需要。所以為了拓寬臍血造血干細胞的臨床應用，需要對臍血造血干細胞進行體外擴增來增加其數量并保持其生物學特性。

理想的造血干細胞體外培養方式是模擬造血干細胞的體內生長環境，使造血干細胞體外擴增同時又保持其體內造血重建的生物學功能。造血干細胞的體外擴增主要有兩種方法：(1)有基質細胞支持的造血細胞共培養；(2)無基質細胞作用的造血細胞單獨培養。

基質細胞主要是通過分泌細胞因子刺激或支持造血干細胞的擴增，但人源的基質細胞系較難獲得，異源基質細胞與人造血干細胞共培養擴增不能滿足臨床應用的要求。而隨著基質細胞產生和分泌的細胞因子被成功鑒定和克隆表達，使用細胞因子組合促使造血干細胞擴增成為可能。目前應用于無基質造血干細胞的培養模式有：靜態培養、動態培養和細胞固定化培養。

靜態培養是造血干細胞的體外擴增培養中最常用的一種方式，它在較簡單的培養裝置中進行，包括孔板、方瓶以及透氣培養袋等。它具有操作簡便、細胞易于收獲等優點，但由于缺少混合，使得培養環境不均一，培養基中pH、溶氧、營養物(細胞因子)和代謝物存在濃度梯度，此濃度梯度還會由于初始條件如接種密度、細胞類型的分布、培養基成分和細胞的擴增程度不同而在各批培養之間造成很大的差異。

與靜態培養相比，動態培養能提供了均一的生長環境，具有良好的混合和傳質效果，便于培養參數的在線檢測和控制，有利于過程放大，已成功地應用于動物細胞的大規模培養。如Zandstra等報道的攪拌式反應器已成功應用于造血干細胞的體外培養，然而，由于造血干細胞對剪切力相當敏感，攪動會影響表面標志的表達，包括細胞因子受體，這在一定程度上影響了造血干細胞的增殖和分化。而且攪拌會使細胞與細胞間處于相對分散的狀態，這不利于細胞之間的相互作用。

采用連續灌注培養方式能增加培養基的交換速率和可溶生長因子的供應，改善傳質限制，維持主體培養基的相對均一性，且不會對造血干細胞造成機械損傷。如Sandstrom，C.E.et?al.(1996)Development?of?novelperfusion?chamber?to?retain?nonadherent?cells?and?its?use?for?comparison?ofhuman‘mobilized’peripheral?blood?mononuclear?cell?cultures?with?and?withoutirradiated?bone?marrow?stroma.Biotechnol.?Bioeng.50，493-504所報道的灌注式培養體系。這種培養腔底部有多個微槽(與培養基流動方向垂直)，可以很好地將細胞保留在腔內，促進細胞間通訊。并且提供了較均一的培養環境，但收獲細胞較困難。而譚文松等發明的“一種造血細胞灌注培養方法和裝置”(中國專利ZL200410016212.5)，雖然能實現連續灌注培養，但細胞處于懸浮離散狀態，存在細胞與細胞之間通訊困難的缺欠。

造血干細胞固定化培養是指利用有孔載體或類似于胞外基質的材料，模擬骨髓微環境的特點，將造血細胞限制在一定的生長范圍內，使細胞高密度生長。由于三維培養系統改善了細胞間、細胞與基質間的相互作用，因此，構建的三維微環境有促進造血細胞增殖，然而造血細胞固定化培養的最顯著缺點是細胞收獲不如懸浮培養那么簡便。

在體內，造血干細胞居于骨髓內，骨髓造血腔內的生化參數如氧壓等可能會決定造血干細胞的擴增和分化趨向。體外培養系統的氧分壓不同也會影響造血干細胞的擴增和分化，有文獻報道，與常氧相比，在低氧情況下，造血干細胞的擴增較少，但同時分化也較少，較原始的造血干細胞所占的比例較高。因此，控制體外培養系統的氧分壓，有望獲得更好的細胞擴增效果。