[發明專利]一種通用熒光標記探針在PCR－LDR基因單核苷酸多態性芯片上的應用無效
| 申請號： | 200710044388.5 | 申請日： | 2007-07-31 |
| 公開（公告）號： | CN101358231A | 公開（公告）日： | 2009-02-04 |
| 發明（設計）人： | 肖君華;陸炯;陳軼群 | 申請（專利權）人： | 上海翼和應用生物技術有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 上海新天專利代理有限公司 | 代理人： | 王巍 |
| 地址： | 200237上海市徐*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 通用 熒光 標記 探針 pcr ldr 基因 核苷酸 多態性 芯片 應用 | ||
1、一種通用熒光標記探針在PCR-LDR基因單核苷酸多態性芯片上的應用，其
特征在于所述應用包括下列步驟：
(1)探針設計
①設計一種由10-25個堿基組成的通用熒光探針，該通用探針具有極高的特異性，在任何生物中找不到其同源相似的序列；
②在要檢測的突變位點的前后各設計10-25堿基長度的序列，其中5’端上游序列是檢測探針，在3’端有檢測位點；3’端下游序列是標記探針；
③據檢測探針的數量，針對每一根檢測探針設計不同的長度為15-25堿基的特異性序列和芯片上探針互補；
④在每個標記探針的3’端引入和通用熒光探針互補的序列；
(2)PCR產物制備
取待檢測DNA?1μl，PCR引物各10-30pmol，高溫聚合酶，高溫聚合酶混合液，相互混合，PCR反應條件為：依次按94℃30秒，40℃-68℃30秒-2分鐘，60-72℃45秒-2分鐘為一次循環，共循環25-40次；
(3)LDR產物制備
取PCR產物1μl取待檢測DNA?1μl，探針各40fmol-10pmol，連接酶，連接酶緩沖液，相互混合。LDR反應條件為：依次按94℃30秒，40-70℃1-10分鐘，以45-60℃為最好作為一次循環，共循環1-40次；
(4)結果檢測
取LDR產物1-5μl與1-10μl雜交液混合，點于基因芯片表面，用蓋玻片覆蓋，30-70℃恒溫10-60分鐘，用洗脫液洗脫1-30分鐘，掃描讀取結果。
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