[發明專利]一種提高RTN4B蛋白產量的方法

有效

• 申請號: 200710044263.2
• 申請日: 2007-07-26
• 公開（公告）號: CN101353641A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 余龍;季國慶;秦波;唐麗莎
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 姚靜芳

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，發明涉及一種新的提高RTN4B表達量的技術手段和方法。

背景技術

RTN家族是一個近年來所發現的新的基因家族。其中神經內分泌特異性蛋白NSP(neuroendocrine-specific?protein)后被統一命名為RTN1，是該家族的第一個成員。根據NSP基因組序列、cDNA序列和核酸序列數據庫比較，發現了另外三個人RTN家族成員(NSP類基因I，II，III)。其中兩個(NSP-like基因I，II)相繼被克隆，并被命名為RTN2和RTN3。RTN4類似于RTN1和RTN2，同樣有C-末端相同的三個異構體(即RTN4A，4B，4C)。RTN4異構體與RTN1/NSP，RTN2，RTN3異構體一樣有著共同的C-末端，并且四者的C-末端都有高度同源性。

研究表明，RTN4B廣泛存在于人的各個組織之中(肝臟除外)可以明顯促進雞胚尿囊膜處和小鼠角膜處的血管增長。創傷愈合實驗表明，人RTN4B蛋白可明顯促進創傷愈合，包括增強細胞的粘附力。RTN4B蛋白可以用于促進創傷處血管愈合，可以作為創傷愈合藥物，尤其是血管生長促進藥物。

發明內容

本發明的目的是提供一種提高RTN4B蛋白產量的方法。

本發明提供了一種提高RTN4B蛋白產量的方法，它包括使用DFO或者氯化鈷等類似缺氧條件的方法提高RTN4B的表達量。

本發明提供了一種提高RTN4B蛋白的產量的方法，即在組織或者細胞的培養環境中加入去鐵胺或者氯化鈷，加入的量為1-500μM(即μmol/L)，處理時間在6小時以上。

本發明中，使用加入50-250μM的去鐵胺的方法提高RTN4B的產量，處理時間為12-48小時。

本發明中，使用加入50-250μM的氯化鈷的方法提高RTN4B的產量，處理時間為12-48小時。

本發明中，去鐵胺的用量可以為90-120μM。

本發明中，氯化鈷的用量可以為75-110μM。

本發明中，DFO是去鐵胺(例如，sigma，D9533)，CoCl₂是氯化鈷(例如，sigma，232696)。

本發明中，“組織或者細胞的培養環境”是指常規的培養環境。例如，在37℃、CO₂含量5％(體積比)的培養箱環境中培養細胞。

本發明中，術語“RTN4B蛋白”指可促進創傷愈合的、序列與NCBI登陸號AAG12177所示多肽序列至少70％同源性的RTN4B多肽及其變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人RTN4B蛋白的活性片段和活性衍生物。

該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人RTN4B?DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人RTN4B多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人RTN4B多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人RTN4B多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人RTN4B多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。

本發明還包括人RTN4B蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人RTN4B多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的具有代表性的多肽。

本發明中，可以將RTN4B蛋白與藥學上的載體或者賦形劑組成的促進創傷愈合的藥物組合物。本發明中，所述的創傷愈合藥物是血管生長促進藥物。