[發明專利]重組人載脂蛋白AI米蘭突變體在畢赤酵母中的表達方法

無效

• 申請號: 200710044022.8
• 申請日: 2007-07-19
• 公開（公告）號: CN101126088A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發明（設計）人: 宋大新;趙志安;張彥;鐘江
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 陸飛;盛志范

1.一種重組人載脂蛋白AI米蘭突變體在畢赤酵母中分泌表達的方法，其特征是將apoAI-milano?cDNA插入表達載體pPIC9k；經Bg/II酶切后電擊導入畢赤酵母GS115中，獲得重組工程菌株；在BMMY培養基中進行搖瓶培養和甲醇誘導，實現rAIM的分泌表達。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于具體操作步驟如下：

(1)構建重組表達質粒

通過重組PCR方法對pPIC9k-apoAI質粒進行定點突變得到重組表達質粒pPIC9k-apoAI-milano，使apoAI?cDNA的第173位Arg的密碼子CGC突變成Cys的密碼子TGT，突變的DNA序列經測序驗證；突變后的apoAI-milano?cDNA插在pPIC9k的Xho?I和EcoRI位點上，大小約為747bp；

(2)篩選酵母工程菌

將重組表達質粒pPIC9k-apoAI-milano經Bg/II酶切，電擊轉化畢赤酵母GS115，在RDB平板上獲得轉化子；轉化子在含G418的YPD平板上進行G418抗性篩選，獲得高抗性菌株；通過搖瓶發酵和SDS-PAGE檢測，篩選得到能分泌表達rAIM的酵母工程菌株；

(3)酵母工程菌株的誘導表達

將高表達的酵母工程菌株接種于BMGY培養基中，培養后分別轉入常規的BMMY培養基或經過優化的BMMY培養基中進行甲醇誘導；這里所述優化的BMMY培養基中誘導；是指用KOH將BMMY培養基的pH調節到6.9-7.1，蛋白胨的用量為BMMY培養基質量的3.9-4.1％；并添加Arg和Ala以及EDTA，添加量：Arg和Ala為BMMY的0.8-1.2％r?W/V，EDTA為4.5-5.5mmol/L，誘導溫度為24-26℃，誘導時間為70-75小時。