[發(fā)明專利]骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710043848.2
• 申請(qǐng)日: 2007-07-17
• 公開（公告）號(hào): CN101126080A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張傳森;溫昱;黨瑞山;李彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/08
• 分類號(hào): C12N5/08
• 代理公司: 上海德昭知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 丁振英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是從骨髓中制備一種骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的方法及其依據(jù)該方法制得的細(xì)胞。

背景技術(shù)

細(xì)胞移植和組織工程是近幾年生物醫(yī)學(xué)工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞由于全能分化性和持續(xù)增殖的能力成為該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，然而倫理學(xué)和免疫原性等問題制約了其在臨床的應(yīng)用，這是細(xì)胞移植和組織工程不能獲得重大突破的關(guān)鍵，尋找新的細(xì)胞來(lái)源是當(dāng)務(wù)之急。

Verfaillie研究組2001年通過優(yōu)化體外培養(yǎng)條件，采用免疫磁珠分選技術(shù)由成年動(dòng)物骨髓中分離得到了一種比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem?cells，MSC)更加原始的早期細(xì)胞群，命名為成體多能祖細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖擴(kuò)增能力，即使超過80倍的細(xì)胞倍增，也不出現(xiàn)增殖衰老現(xiàn)象，最長(zhǎng)培養(yǎng)達(dá)到120代，而且在培養(yǎng)過程中，成體多能祖細(xì)胞仍保持長(zhǎng)的端粒，不隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而縮短。40代時(shí)成體多能祖細(xì)胞的平均端粒長(zhǎng)度為27kb，而102代時(shí)檢測(cè)成體多能祖細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度沒有任何改變。成體多能祖細(xì)胞另一個(gè)重要特征在于其多向分化能力，不僅可以誘導(dǎo)分化成為間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞(骨、軟骨、脂肪、肌組織)；也可以誘導(dǎo)分化為有神經(jīng)外胚層表型和功能的細(xì)胞；而且在體外可以誘導(dǎo)成為具有功能特征的血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。目前成體多能祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的細(xì)胞類型已經(jīng)包括了內(nèi)、外、中胚三個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞。尤其是將成體多能祖細(xì)胞導(dǎo)入早期的胚囊中，可以發(fā)育成絕大多數(shù)組織細(xì)胞類型，進(jìn)一步證明了成體多能祖細(xì)胞具有比MSC更強(qiáng)的多向分化潛能，更強(qiáng)大的增殖擴(kuò)增能力。這種具有高度多向分化性的亞全能干細(xì)胞為我們的研究提供了新的思路，也為組織工程尋找新的種子細(xì)胞帶來(lái)了希望。該種細(xì)胞逐漸引起了人們的重視。但是很多學(xué)者對(duì)這種說法產(chǎn)生了質(zhì)疑，認(rèn)為成體多能祖細(xì)胞還是一群混合的細(xì)胞，沒有完全純化，或者是從不同的角度進(jìn)行研究得到的已知骨髓源干細(xì)胞。

2004年P(guān)ochampally?RR等在不含細(xì)胞因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中培育早期人MSC2-4周。發(fā)現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞亞群能夠在無(wú)血清環(huán)境中存活，而且具有更長(zhǎng)的端粒；RT-PCR分析表明，該細(xì)胞亞群是一個(gè)早期祖細(xì)胞亞群，增強(qiáng)表達(dá)Oct-4和其它胚胎細(xì)胞特異表達(dá)的基因。2005年Yoon?YS等在成人骨髓中發(fā)現(xiàn)一種干細(xì)胞亞群，具有自更新能力，擴(kuò)增140代以后仍不損失多能性，能分化成所有三胚層細(xì)胞。根據(jù)表面標(biāo)志表達(dá)，這些克隆擴(kuò)增的細(xì)胞不屬于任何先前所知的骨髓來(lái)源干細(xì)胞群，命名為人骨髓來(lái)源多能干細(xì)胞(human?bone?marrow?stem?cells，hBMSCs)。心肌梗塞后于心肌內(nèi)移植hBMSCs，結(jié)果移植的細(xì)胞大量嫁接，局部標(biāo)志心肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞特征，與hBMSCs體內(nèi)多線系分化相一致。心肌梗塞后移植hBMSCs的有益效果，可能緣自于宿主心肌組織增殖和保存增強(qiáng)、以及hBMSCs分化用于組織再生和修復(fù)。2006年Kucia?M等在鼠骨髓中鑒別出少量均勻的Sca-1(+)lin(-)CD45(-)細(xì)胞群落，其帶有多能干細(xì)胞標(biāo)志，如SSEA-1、Oct-4、Nanog和Rex-1。電鏡分析表明，這些細(xì)胞很小，細(xì)胞質(zhì)圍繞大的細(xì)胞核形成窄邊，還包含開放型染色質(zhì)，這是胚胎干細(xì)胞的典型特征。體外培養(yǎng)這些細(xì)胞可以分化成所有三胚層細(xì)胞系。猜測(cè)該群落為成體骨髓中遺留的少量胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞，命名為胚胎源性多能干細(xì)胞(embryonic?origin?pluripotentstem?cell，EOPSC)。

2007年Kucia?M等提出骨髓中存在多能干細(xì)胞原始群(founderpopulation?ofpluripotent?stem?cells，PSC)的概念。認(rèn)為胚胎發(fā)育時(shí)部分原始胚芽細(xì)胞(primordial?germ?cells，PGC)被存放到各種器官組織中，比如骨髓，隨個(gè)體發(fā)育，這部分細(xì)胞沒有分化為體細(xì)胞，而是保持了胚胎時(shí)的狀態(tài)，持續(xù)存在。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)骨髓中確實(shí)存在一種小胚胎樣(verysmall?embryonic-like，VSEL)干細(xì)胞，表達(dá)Oct-4、SSEA-4等胚芽細(xì)胞特定的表面標(biāo)志。因此認(rèn)為原始胚芽細(xì)胞可能存在于成體骨髓中，由于不同的機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞狀態(tài)、選擇表達(dá)不同的基因，導(dǎo)致了這些細(xì)胞不同的命運(yùn)。我們假設(shè)這些細(xì)胞在組織/器官的再生中起重要作用，所以它們的存在可以解釋干細(xì)胞的可塑性。但是病理?xiàng)l件下它們可能惡性轉(zhuǎn)化，形成腫瘤。