[發明專利]褐牙鲆精子快速冷凍保存方法

無效

• 申請號: 200710043611.4
• 申請日: 2007-07-09
• 公開（公告）號: CN101342192A
• 公開（公告）日: 2009-01-14
• 發明（設計）人: 章龍珍;莊平;閆文罡;黃曉榮;張濤;馮廣朋;趙峰
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: A61K35/52
• 分類號: A61K35/52;A01N1/02
• 代理公司: 上海東方易知識產權事務所
• 代理人: 歐陽俊立

技術領域：

本發明涉及海水魚類精子保存方法。

背景技術

褐牙鲆(Paralichthys?olivacens)俗稱比目魚，屬鰈形目，鲆科、牙鲆屬，是近海暖溫性底層魚類。其自然分布區主要是中國沿海、朝鮮、日本和俄羅斯的亞洲海區。其適應性強，生長快、個體大、肉質細嫩鮮美，并有消炎解毒、健脾益氣等功效，是名貴的重要海水養殖品種之一。由于國際市場大量需求，從上世紀80年代末至90年代初，褐牙鲆遭到大量的捕撈，資源受到嚴重的破壞。為了彌補資源的不足和滿足市場的需求，在上世紀90年代初，我國引進的歐洲一些品種如大菱鲆，已成為工廠化海水養殖的主要品種之一。而褐牙鲆是我國土族種，由于受到過渡捕撈和環境等因素的影響，種質資源越來越少。

現有大菱鲆、牙鲆精子的冷凍保存方法，該方法為：精子的稀釋液為MPRS、TS-19、TS-2等完全人工配制；抗凍劑為10％濃度的二甲亞砜(DMSO)；降溫方法液氮面上6cm處10分鐘，液氮面上5分鐘，進入液氮保存。精子活率最高70％。

褐牙鲆精子的冷凍保存關系到我國這種物種保護，但是目前還缺乏適合褐牙鲆精子快速冷凍保存的方法。現有技術用冰點滲透壓儀首先測出精漿滲透壓(mOsm/kg)，根據滲透壓進行精子稀釋液的配制，精子稀釋液主要采用NaCl、KCl、葡萄糖等配制，要配制出適合于精子保存的稀釋液需經過反復多次的實驗才能獲得；抗凍劑用二甲亞砜，二甲亞砜對精子的毒性作用較大，影響精子的保存效果；降溫過程一般應用程序降溫儀降溫，需配備程序降溫儀；保存容器為液氮罐。

發明內容

本發明需要解決的技術問題是提供一種操作簡便，適合快速保存褐牙鲆精子，同時能獲得較高精子活率的冷凍保存方法。

本發明的技術方案包括稀釋液、抗凍劑、冷凍保護液配制，精子與保護液混合放入離心管中投入液氮中保存，其特征是將天然海水稀釋，用稀釋的海水激活精子，以不能激活精子的稀釋海水作為保存精子的稀釋液；采用濃度為14g/100ml乙二醇，或濃度為3g/100ml乙二醇+濃度為3g/100ml二甲亞砜作為抗凍劑；上述稀釋液+抗凍劑作為冷凍保護液，將冷凍保護液在4℃的恒溫箱預冷；精子與冷凍保護液按1:1或1:1.5或1:2或1:2.5或1:3比例均勻混合放入離心管中，將離心管置于液氮罐口下-20℃平衡1min，然后快速投入液氮中保存。

本發明用褐牙鲆生存環境的天然海水稀釋作為褐牙鲆精子的稀釋液，避免人工配制精子稀釋液要經過多次反復實驗才能確定各種離子成分和離子濃度的煩瑣操作，同時人工配制的稀釋液由于缺乏一些天然的微量元素，所以人工配制的稀釋液不能完全滿足保存精子的需要，對精子的保存效果不好，影響精子的成活率。現有技術精子保存采用的抗凍劑是二甲亞砜，而本發明用乙二醇(EG)作為抗凍劑添加到稀釋液中作為抗凍保護液，保存褐牙鲆精子，使褐牙鲆精子冷凍保存后獲得的成活率達到90％以上，成活時間達255s±13.45s。采用EG(3ml/100ml)+DMSO(3ml/100ml)兩種抗凍劑作為組合抗凍劑，除可以獲得較好的冷凍保存效果外(冷凍后精子的成活率達到90％以上)，兩種組合抗凍劑還可以延長冷凍后精子的成活時間，成活時間長達540s±60s，比單用乙二醇保存的成活時間長285s。本發明通過液氮罐口下-20℃平衡1分鐘，快速投入液氮保存，步驟簡單，不需要昂貴的程序降溫儀，同樣達到較好的保存效果。野外操作時只需配帶5-10升的液氮罐和一個保溫瓶，就可以進行精子的冷凍保存，避免了目前野外采集到的精子必須帶回實驗室才能進行冷凍保存，精子采集時間過長或長途運輸對精子的冷凍保存會造成很大的影響，直接影響到冷凍精子的成活率。

具體實施方式

本發明采用褐牙鲆生存環境的天然海水(其鹽度為31)稀釋，例如將鹽度為31的海水稀釋0.5、1、1.5、2、2.5、3倍，用稀釋的海水激活精子，以不能激活精子的稀釋海水作為保存精子的稀釋液，經低溫冷凍保存后，檢測精子的成活率來確定最適合冷凍保存的稀釋液，經實驗選擇稀釋1倍海水最適合作為褐牙鲆精子的稀釋液；通過不同抗凍劑、不同濃度對精子冷凍保存效果的比較，確定乙二醇(EG)作為抗凍劑，濃度為14g/100ml，或EG(3g/100ml)加DMSO(3g/100ml)作為抗凍劑添加到稀釋液中作為褐牙鲆的低溫冷凍保護液，將冷凍保護液置于4℃下預冷，將預冷過的保護液取出，精子與保護液可按1:1、1.5、2、2.5、3的比例稀釋，按1:15比例稀釋的效果最好，將稀釋好的精子裝入200μl的塑料離心管中，置于液氮罐口下-20℃平衡1分鐘，然后將其快速投入液氮保存；解凍時離心管快速從液氮中提出，置于38℃水浴中解凍。采用本方法冷凍保存褐牙鲆精子，冷凍后精子的活率達90％以上。該方法與保存大菱鲆、牙鲆的方法比較，冷凍后精子的活率提高20％以上，是目前淡水和海水魚類精子冷凍保存后獲得精子活率最高的方法。