[發明專利]果蠅抗菌肽的制備方法

無效

• 申請號: 200710043031.5
• 申請日: 2007-06-29
• 公開（公告）號: CN101333254A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 后嘉毅
• 申請（專利權）人: 上海市上海中學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司
• 代理人: 吳澤群

技術領域

本發明涉及生物領域，具體地說是涉及一種利用果蠅制備抗菌肽的方法。

背景技術

抗菌肽是昆蟲浸染微生物等因素后在短時間內產生的抗菌物質?？咕姆肿恿枯^小，具有對熱穩定、水溶性好、廣譜抗菌等特點，而且與抗生素的抗菌機理完全不同，已成為新型抗菌、抗癌藥物研究開發的目標，有著廣闊的發展前景。

黑腹果蠅屬于雙翅目、果蠅科、果蠅屬，它體形小，成蠅體長約0.5cm。雄性果蠅成蟲腹部有7條環紋，有性梳。雌性果蠅成蟲腹部有5條環紋，沒有性梳。

果蠅繁殖快，生活周期分為卵→幼蟲→蛹→成蟲4個明顯的時期。卵長約0.5mm、白色，前端背面的觸絲能附著在食物或瓶壁上。卵經22～24h孵化為幼蟲，幼蟲約4～5mm，頭部稍尖，有一黑色鉤狀口器。幼蟲生活約4天左右化蛹，顏色淡黃、柔軟，逐漸硬化變成深褐色，此時即將羽化成果蠅成蟲。

果蠅喜好以腐敗的水果等作為食物，從幼蟲到成蟲都生活在雜菌橫生的污濁環境中，隨時都有被病菌感染的機會，但它們卻有著極強的適應惡劣環境的生存能力，預示著它們體內存在著獨特的免疫防御機制，可能會產生抗菌肽。但長期以來由于人們對果蠅的研究往往偏重在遺傳學上，又加果蠅個體小，故其經濟價值未被深入開發，國內對其研究較少。

發明內容

本發明目的在于提供一種制備果蠅抗菌肽的方法。

本發明的技術方案為利用誘導培養的方法，用細菌或真菌誘導果蠅成蟲產生抗菌肽。

具體做法為：用毛細針蘸細菌懸液，如金黃色葡萄球菌懸液，針刺果蠅腹部后培養；

或者將將果蠅置于含有真菌，如青霉的環境下培養。

將上述誘導后的果蠅加入Tris-HCl緩沖液，研磨果蠅至漿狀，離心后取上清液，即得到果蠅抗菌肽。

經檢測，本方法得到的果蠅抗菌肽對細菌和真菌有抑制作用?？咕臒岱€定性較好，40℃、60℃、80℃和100℃處理10分鐘仍保持抗菌活性。

自然培養的果蠅成蟲體內不存在抗菌肽，通過本方法能誘導果蠅產生對細菌和真菌有抑制作用的抗菌肽。金黃色葡萄球菌能誘導果蠅產生抗菌肽，其抗菌肽不僅對金黃色葡萄球菌產生抗菌作用，也對大腸肝菌產生抗菌作用；青霉培養法誘導果蠅成蟲產生的抗菌肽對青霉有抑制作用。該抗菌肽熱穩定性較好，40℃、60℃、80℃和100℃處理10分鐘仍保持抗菌活性。

具體實施方式

配制玉米粉果蠅培養基，121℃滅菌20min。用乙醚將原種瓶中的果蠅麻醉后，移入裝有玉米粉培養基的培養瓶中，每瓶5對，25℃恒溫培養。約7天后，用放大鏡對果蠅幼蟲和成蟲的身體特征進行觀察。

實施例1用金黃色葡萄球菌誘導抗菌肽

配制牛肉膏培養基121℃滅菌20min。劃線法將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種在牛肉膏培養基斜面上，37℃培養24h。

取1支金黃色葡萄球菌斜面，分別加入5ml生理鹽水(0.9％NaCl溶液)，用接種針輕輕刮取菌體后移入無菌試管中，充分振蕩，制成金黃色葡萄球菌菌懸液。

針刺法：乙醚麻醉果蠅成蟲，用毛細針蘸金黃色葡萄球菌菌懸液后，針刺果蠅腹部。刺傷后的果蠅繼續于25℃培養24h。

實施例2用青霉菌誘導抗菌肽

配制PDA培養基，121℃滅菌20min。劃線法將青霉接種在PDA培養基斜面上，28℃培養4-5天。

培養法：乙醚麻醉果蠅成蟲，移入長滿青霉的培養瓶中，在25℃培養4-5天。

實施例3抗菌肽的提取

分別取實施例1和2誘導得到的果蠅成蟲，乙醚麻醉果蠅成蟲，稱重，以20：1的比例加Tris-HCl緩沖液，研磨果蠅至漿狀。提取液3500r/min離心10min，上清液4℃保存。

實施例4抗菌活性的檢測

配制牛肉膏培養基和PDA培養基，121℃滅菌20min。劃線法將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種在牛肉膏培養基斜面上，37℃培養24h。劃線法將青霉接種在PDA培養基斜面上，28℃培養4-5天。

各取1支大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和青霉斜面，分別加入5ml生理鹽水(0.9％NaCl溶液)，用接種針輕輕刮取菌體或孢子后，移入無菌試管中，充分振蕩，制成大腸桿菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液和青霉孢子懸液。

(1)抗細菌活性：

取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液以及青霉孢子懸液各1ml，分別加入溶化而不燙手的100ml牛肉膏培養基和PDA培養基中，充分振蕩后，傾倒入無菌培養皿中，每個培養皿約20ml。靜置即得大腸桿菌檢定板、金黃色葡萄球菌檢定板和青霉檢定板。