[發(fā)明專利]添有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的副溶血弧菌PCR檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710042898.9
• 申請(qǐng)日: 2007-06-28
• 公開（公告）號(hào): CN101109019A
• 公開（公告）日: 2008-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 史賢明;龍飛;施春雷;陳萬(wàn)義;張忠明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種食品安全技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是一種添有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的副溶血弧菌PCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

PCR，英文polymerase?chain?reaction的縮寫，是指：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。副溶血弧菌(Vibrio?parahaemolyticus)是弧菌科弧菌屬的一種嗜鹽性細(xì)菌，革蘭氏陰性，不產(chǎn)芽孢，呈弧形、桿狀或絲狀等多種形態(tài)，存在于近岸海水、海底沉積物和魚類、貝類等海洋生物中。該菌是引起食源性疾病的一種重要致病菌。當(dāng)人食用了污染該菌又未經(jīng)適當(dāng)加工的海產(chǎn)品如蟹、牡蠣、蝦、貝等就會(huì)出現(xiàn)中毒。國(guó)家食源性疾病監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)顯示，1998年以來(lái)在被監(jiān)測(cè)的省市中，副溶血弧菌中毒的發(fā)生規(guī)模和副溶血弧菌人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，并且超過(guò)沙門氏菌食物中毒，躍居首位，嚴(yán)重地阻礙著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和影響人民的健康。因此，通過(guò)發(fā)展快速的檢測(cè)技術(shù)來(lái)解決食品安全問(wèn)題是國(guó)家的迫切需求。我國(guó)目前對(duì)食品中副溶血弧菌的國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)方法還是采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，由于此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，已不能滿足食品生產(chǎn)與消費(fèi)中對(duì)致病菌快速檢測(cè)的需要。

在1992年，Tada?J等人率先以副溶血弧菌帶有的編碼耐熱直接溶血素TDH和不耐熱直接溶血素TRH基因(tdh，trh)設(shè)計(jì)引物，用于副溶血弧菌的PCR檢測(cè)，詳見：Tada?J，Ohashi?T，Nishimura?N，et?al.“Detection?of?the?thermostable?direct?hemolysin?gene(tdh)and?the?thermostable?direct?hemolysin-related?hemolysin?gene(trh)of?Vibrio?parahaemolyticus?by?polymerase?chain?reaction”.Molecular?and?Cellular?Probes.1992，6(6)：477-487.(Tada?J，Ohashi?T，Nishimura?N，等，‘以副溶血弧菌的耐熱直接溶血素TDH和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素TRH基因序列作為檢測(cè)基因應(yīng)用于副溶血弧菌的PCR檢測(cè)”，分子與細(xì)胞探針，1992，6(6)：477-487)。此后，針對(duì)副溶血弧菌的PCR檢測(cè)技術(shù)開始廣泛應(yīng)用，用于檢測(cè)的基因不斷的增多，設(shè)計(jì)的引物也日益多樣。利用PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)副溶血弧菌的檢測(cè)具有快速、靈敏和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。但是大多數(shù)的檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)是在基因測(cè)序工作開展和生物信息學(xué)發(fā)展之前，時(shí)有錯(cuò)檢和漏檢發(fā)生，造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)，例如，副溶血弧菌的tdh基因與最小弧菌(V.mimicus)、霍亂弧菌(V.cholerae)和豪氏弧菌(V.hollisae)的tdh基因分別有96％、95％和93％的同源性，所以用tdh，trh基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)容易造成誤檢。1999年Kim等報(bào)道以toxR基因序列作為副溶血弧菌種的靶基因用于副溶血弧菌的PCR檢測(cè)，詳見：Kim?YB，Okuda?J，Matsumoto?C，et?al.“Identification?of?Vibrio?parahaemolyticus?strains?at?the?species?level?by?PCR?targeted?to?the?toxR?gene”.Journal?of?Clinical?Microbiology，1999，37：1173-1177.(“運(yùn)用PCR方法以toxR基因?yàn)榉N特異性靶基因檢測(cè)副溶血弧菌”.臨床微生物學(xué).1999，37：1173-1177)。toxR基因是副溶血弧菌的調(diào)控基因，通過(guò)BLAST比對(duì)分析，toxR基因與霍亂弧菌的toxR基因同源性只有52％，與其它菌的同源性也很低，因此，以該基因做為種特異性靶基因來(lái)鑒定副溶血弧菌具有一定的優(yōu)勢(shì)。目前，PCR方法在不同的實(shí)驗(yàn)室或檢測(cè)部門所檢測(cè)的目的基因和操作流程有一定的差異，沒有形成標(biāo)準(zhǔn)，得到的檢測(cè)結(jié)果也不盡相同。近年來(lái)的實(shí)踐應(yīng)用表明，食品和培養(yǎng)基中存在的抑制劑可影響PCR反應(yīng)，使檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。盡管PCR方法在不斷的改進(jìn)和完善，卻不能有效地阻止假陰性結(jié)果的發(fā)生。