[發明專利]組織工程化靜脈瓣及其制備方法

有效

• 申請號: 200710042652.1
• 申請日: 2007-06-26
• 公開（公告）號: CN101073678A
• 公開（公告）日: 2007-11-21
• 發明（設計）人: 溫昱;張傳森;黨瑞山;李彬
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61F2/24
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁振英

1.一種組織工程化靜脈瓣移植體，由種子細胞和支架構成，其特征在于所述的種子細胞是成體多能祖細胞MAPC和內皮祖細胞EPC，所述的支架是同種異體去細胞帶瓣靜脈，并以如下方法制備得到：

I.骨髓成體多能祖細胞MAPC和內皮祖細胞EPC的分離、培養、純化、擴增和鑒定

全骨髓培養法培養成年骨髓中MAPC和EPC，取成年個體骨髓10ml，注入條件培養基，棄去不貼壁細胞，傳代培養獲得MAPC，以≥10⁷/ml的密度接種到預鋪纖維連接蛋白的培養皿上或培養瓶中；

II.MAPC向平滑肌細胞、EPC向血管內皮細胞EC的誘導分化和鑒定

以含10％胎牛血清的DMEM培養液添加IGF、bFGF誘導MAPC，使之分化為平滑肌細胞，以I型膠原包被的培養皿，利用含15％胎牛血清的M199誘導EPC，使之分化為內皮細胞；

III.異體去細胞靜脈瓣支架的制備及修飾

選取異體成年雙側下肢相應靜脈分割成數段，每段長2-4cm，保證每段均帶有靜脈瓣，采用超純水浸泡、Triton-X-100、氨水處理、核糖核酸酶消化步驟得到脫細胞靜脈瓣支架；

IV.組織工程化靜脈瓣的體外構建

將MAPC和EPC以≥10⁶/ml的濃度按先支架壁內種植MAPC后支架內表面種植EPC的順序將兩種細胞與脫細胞靜脈瓣支架復合，將復合了種子細胞的支架置于血管自動旋轉脈動培養系統內進行體外構建4-6周，即成組織工程化靜脈瓣。

2.根據權利要求1所述的一種組織工程化靜脈瓣移植體，其特征在于其中的成體多能祖細胞MAPC和內皮祖細胞EPC來源于自身骨髓成體。

3.權利要求1所述的組織工程化靜脈瓣移植體的制備方法，其特征在于具體步驟如下：

I.骨髓成體多能祖細胞MAPC和內皮祖細胞EPC的分離、培養、純化、擴增和鑒定

全骨髓培養法培養成年骨髓中MAPC和EPC，取成年個體骨髓10ml，注入條件培養基，棄去不貼壁細胞，傳代培養獲得MAPC，以≥10⁷/ml的密度接種到預鋪纖維連接蛋白的培養皿上或培養瓶中；

II.MAPC向平滑肌細胞、EPC向血管內皮細胞EC的誘導分化和鑒定

以含10％胎牛血清的DMEM培養液添加IGF、bFGF誘導MAPC，使之分化為平滑肌細胞，以I型膠原包被的培養皿，利用含15％胎牛血清的M199誘導EPC，使之分化為內皮細胞；

III.異體去細胞靜脈瓣支架的制備及修飾

選取異體成年雙側下肢相應靜脈分割成數段，每段長2-4cm，保證每段均帶有靜脈瓣，采用超純水浸泡、Triton-X-100、氨水處理、核糖核酸酶消化步驟得到脫細胞靜脈瓣支架；

IV.組織工程化靜脈瓣的體外構建

將MAPC和EPC以≥10⁶/ml的濃度按先支架壁內種植MAPC后支架內表面種植EPC的順序將兩種細胞與脫細胞靜脈瓣支架復合，將復合了種子細胞的支架置于血管自動旋轉脈動培養系統內進行體外構建4-6周，即成組織工程化靜脈瓣。