[發明專利]細菌基因組DNA抽提液及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 200710041754.1
• 申請日: 2007-06-07
• 公開（公告）號: CN101319213A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 劉曉穎;馬敏;王迅;鄭嵐;錢開誠
• 申請（專利權）人: 上海市血液中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/31
• 代理公司: 上海光華專利事務所
• 代理人: 余明偉;解文霞

技術領域

本發明涉及一種從血液、血小板制品中抽提細菌基因組DNA的提取液和制備方法及使用該抽提液提取細菌基因組DNA的方法。

背景技術

血液、血小板制品中存在的細菌污染問題成為危脅血液制品安全的一大隱患。近年來備受重視。以往對于細菌污染的檢測都是基于傳統的培養方法，這種方法耗時長一般需要24小時得出初步報告，七天獲得最終報告。而對于一些菌量少或難以培養的細菌易產生假陰性結果，危及了輸血的安全性。隨著分子生物學技術的發展，PCR、熒光定量PCR技術被廣泛地應用于細菌的診斷中。這不僅使原來難以培養的細菌得以檢出，而且大大縮短了檢出時間。在這一操作過程中，細菌基因組抽提工作至關重要。

常規使用的商品化細菌基因組抽提試劑盒，基于SDS/酚/氯仿提取，為提高裂解效果，通常加入溶菌酶，增強細菌細胞壁的裂解效果。溶菌酶可以切斷N—乙酰葡糖胺與N—乙酰胞壁酸之間的β-1，4鍵分子連接，從而破壞細菌細胞壁結構。但對于一些細胞壁的結構比較特殊的細菌，如金黃色葡萄球菌，其基因組DNA不能有效地釋放出來，因此不能使用溶菌酶進行溶菌。

另外，常規使用的細菌基因組抽提試劑盒操作復雜，從收集細菌到獲得基因組DNA要經歷十多步驟，其間很容易引入細菌或其基因組DNA的污染。因此需要一種快速，有效地適用于從血液、血小板制品中提取細菌基因組DNA的方法。

發明內容

本發明的目的之一就在于提供一種新的細菌基因組DNA抽提液，該種DNA抽提液可方便抽提細菌基因組DNA，且抽提效率高。

本發明的另一個目的是提供上述細菌基因組DNA抽提液的制備方法。

本發明的另一個目的是提供上述細菌基因組DNA抽提液的具體使用方法。

為達上述目的，本發明采取的具體技術方案是：

一種細菌基因組DNA抽提液，由體積百分比為50～70％的甲液和30～50％的乙液組成，其中

甲液是由chelex-100、SDS、NP-40和吐溫組成，且濃度分別為5％～20％g/ml、0.03％～3％g/ml、0.5％～5％V/V和0.5％～5％V/V，其余為水；

乙液是由溶葡萄球菌素、破壁酶(10U/μl)和蛋白酶K(20mg/ml)組成，且體積比為0.5～1.5∶4.5～5.5∶0.75～1.75。

上述的乙液中，溶葡萄球菌素的原液濃度優選為2mg/ml，破壁酶10U/μl，蛋白酶K20mg/ml。

上述細菌基因組DNA抽提液的制備方法，包括下列步驟：

①取SDS、NP-40和吐溫加入水中混合，然后過濾除菌，最后加入適量chelex-100，配成濃度分別為SDS?0.03％～3％g/ml、NP-400.5％～5％V/V、吐溫0.5％～5％V/V和chelex-1005％～20％g/ml的混合物，制得甲液；

②將溶葡萄球菌素、破壁酶和蛋白酶K的原液按0.5～1.5∶4.5～5.5∶0.75～1.75的體積比混合，YM-100蛋白過濾柱過濾后離心，制得乙液；

③按比例將經步驟①得到的甲液加入步驟②得到的乙液中。

在本抽提液中，甲液可以部分程度地破壞細菌細胞壁，而且chelex-100作為一種弱酸性鰲合交換劑，對多價陽離子具有很強的選擇度，可以有效去除這類污染雜質對后續PCR反應的抑制作用。而乙液的加入通過多重酶的聯合作用進一步增強對細菌細胞壁的裂解效果，促進了細菌基因組DNA的釋放。

使用本發明的抽提液，用以提取血液及血小板制品中細菌DNA的方法，包括以下步驟：

①取標本50～5000μl，10000～15000g/分鐘，離心10～15min收集細菌；

②棄上清液，加入上述的抽提液25～250μl；

③30～37℃孵育30～60分鐘，50～65℃孵育20～120分鐘；

④加熱煮沸5～20分鐘，于0℃放置5～120秒；

⑤10000～15000g/分鐘，離心10～15分鐘，所得上清液即為細菌基因組DNA。

本發明的優點和有益效果：

在本發明中，利用了細菌細胞壁的特點和DNA的性質，基于這些特點和性質創造了從血液及血小板中提取細菌基因組DNA方法。與其它常規細菌DNA提取方法相比，本發明有幾個明顯的優點和有益效果：