[發明專利]月季RcHsp17.8編碼序列及其應用

無效

• 申請號: 200710041158.3
• 申請日: 2007-05-24
• 公開（公告）號: CN101100668A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發明（設計）人: 胡永紅;明鳳;蔣昌華
• 申請（專利權）人: 上海植物園;復旦大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明涉及分子生物學、生理學以及基因工程技術領域，具體涉及一種在月季中表達的RcHsp17.8(月季熱激蛋白，Rosa?chinensis?Heat?shock?protein，RcHsp17.8)的克隆，拷貝數分析，基因表達模式分析，轉基因載體的構建，大腸桿菌的轉化，轉基因菌株的獲得及其耐熱、耐冷性能鑒定。

背景技術

由于“溫室效應”現象日益明顯，全球氣溫持續升高，夏季高溫已成為制約植物生長和發育的主要環境因子，植物生長發育面臨高溫逆境的嚴峻挑戰。熱激蛋白(heat?shockprotein，HSPs)是HSPs一類在有機體受到高溫等逆境刺激后大量表達的蛋白，根據分子質量大小將其分成HSP110s、HSP90s、HSP70s、HSP60s和小分子熱激蛋白(smHSPs)。smHSPs包括細胞質I類smHSPs、細胞質II類smHSPs、葉綠體smHSPs、線粒體smHSPs和內質網smHSPs。熱激蛋白是植物對逆境脅迫短期適應的必需組成成分，對減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。有機體在受到逆境脅迫后，體內變性蛋白急劇增加，熱激蛋白可以與變性蛋白結合，維持它們的可溶狀態，在有Mg²⁺和ATP的存在下使解折疊的蛋白質重新折疊成有活性的構象。已有研究證明HSPs的主要功能是參與新生肽的折疊以及蛋白質變性后的復性、降解，維持胞內環境的穩定，起分子伴侶(molecular?chaperones)的作用。

雖然植物熱激蛋白的研究起步較晚，但已成為當今分子生物學，蛋白質生物化學和植物抗逆生理的一個重要研究內容，其中心問題是HSPs的生物學功能。許多研究表明，HSPs的生成量與生物耐熱性呈正相關。也有研究表明HSPs與植物的抗冷性相關，Collins等(1995)首先證實了HSPs和耐冷性的直接關系；Adnan等(1998)證明熱激下產生的smHSP能夠減輕番茄冷傷害。Alvaro等(1999)實驗證明，將栗子(Castanea?sativa)CsHSP17.5基因轉入大腸桿菌顯著提高轉基因菌株對高溫(50℃)及低溫(4℃)的耐受性。

隨著生活水平的提高，園林觀賞植物越來越受到人們關注，研究觀賞植物對溫度逆境抗性的遺傳機制有廣泛的應用前景。

本發明研究了一種從月季中克隆小分子熱激蛋白基因，并轉入大腸桿菌后提高轉基因菌株對高溫、低溫抗性的技術，應用該技術不僅可以提高原核生物的溫度抗性，而且預期可以提高轉基因植物的溫度抗性。

在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的月季RcHsp17.8序列及其核酸序列。

發明內容

本發明的第一目的就是提供一種新的月季基因RcHsp17.8(SEQ?ID?NO.1)，該基因是一個胞質Class?I小分子熱激蛋白基因。

本發明的第二目的是提供這種月季熱激蛋白RcHsp17.8編碼序列在利用轉基因技術提高大腸桿菌對高溫、低溫耐受性的應用。

本發明一方面從月季分離出了一種DNA分子，其核苷酸序列見SEQ?ID?NO.1所示。它是一種小分子熱激蛋白基因，該基因長度為465bp。

本發明另一方面得到了一種蛋白質分子，它編碼具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列的多肽，由154個氨基酸殘基組成，分子量為17885.33道爾頓，pI為8.876。

本發明還提供一種檢測RcHsp17.8mRNA表達模式的方法，其步驟如下：

(1)耐熱性能差異顯著的兩個月季品種二年生嫁接苗于25℃常溫及38℃熱激處理3小時，分別提取它們嫩葉的總RNA(RNAplant，市售)。

(2)利用反轉錄試劑盒(市售)將總RNA反轉錄成cDNA，然后根據RcHsp17.8的開放讀框的第1-20，446-465的特異序列設計引物，進行PCR。

本發明還提供一種利用轉基因技術將編碼月季熱激蛋白RcHSP17.8的核苷酸序列轉化到大腸桿菌以提高其溫度耐受性的方法，其步驟如下：

(1)將RcHSP17.8基因的開放閱讀框可操作地連接于原核表達載體，形成含有該基因的原核表達載體；