[發明專利]一種抗菌肽的多肽片段及其核苷酸序列和應用

有效

• 申請號: 200710040727.2
• 申請日: 2007-05-16
• 公開（公告）號: CN101307100A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發明（設計）人: 胡又佳;陳國澤;楊濤;朱春寶
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N1/21;A61K38/17;A61K8/64;A23K1/16;A23L3/3526
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 薛琦

技術領域

本發明涉及一種來自采采蠅(Glossina?morsitans?morsitans)抗菌肽 Attacin的多肽片段attP1，編碼該多肽片段attP1的DNA序列，含有該DNA 序列的表達載體、轉化體和重組多肽片段attP1的制備方法，以及多肽片段 attP1的用途。

背景技術

抗菌肽是20世紀70年代研究昆蟲免疫系統時發現的一類具有抗菌特性 的小分子多肽。昆蟲抗菌肽具有分子量小、熱穩定高、水溶性好、殺菌力強、 抗菌譜廣等優點，對細菌、真菌、病毒、腫瘤細胞均有明顯的殺傷作用，而 對正常真核細胞無毒害作用。這就使得研究人員對抗菌肽產生了濃厚的興 趣，并在誘導釋放、抗菌機理、結構功能、重組表達等各個方面進行了深入 的研究。

隨著傳統抗生素長期廣泛使用及人為濫用等因素，細菌及其他微生物的 耐藥性問題日趨嚴重，一些常見的臨床致病菌的耐藥情況尤為突出。耐藥菌 問題已成為當今全球的公共健康問題。人們在對傳統抗生素不斷進行改造的 同時，也積極研究和開發新型抗生素。抗菌肽具有對病原微生物的廣譜性、 選擇毒性、不易產生耐藥性等特點，被認為是解決細菌耐藥性問題的有效途 徑之一。現已有將抗菌肽應用于保鮮劑、化妝品如護膚霜等方面的報道。

此外，隨著人們對食品和環境質量的要求越來越高，對抗生素的副作用 認識日益加深，抗生素在飼料業中的應用，已面臨著淘汰或禁用的局面。應 用無毒無公害的新型抗菌劑代替抗生素作飼料添加劑，已成為當前國內外飼 料學科的一項重要內容。因此應用生物技術研究與開發新型抗菌劑——抗菌 肽也是我國飼料科學界一項緊迫的任務。

Attacin是一類昆蟲抗菌肽，一般由180～270個氨基酸殘基組成。由于 提取生物體內的天然抗菌肽工序繁、得率低，因此，進行抗菌肽的基因克隆 表達研究并改良出具有無毒性、高效的新型抗菌肽顯得至關重要。尤其是 Attacin分子量比較大，作為藥用的時候，具有比較強的免疫原性，故應用基 因重組技術進行改造，降低分子量顯得尤為迫切。

發明內容

本發明要解決的技術問題即是提供一種抗菌肽Attacin的多肽片段及編 碼其核苷酸序列，該多肽片段具有與全長Attacin相當的抗菌活性。

本發明人經過試驗篩選出來自采采蠅(Glossina?morsitans?morsitans)的 抗菌肽Attacin，其全長由180個氨基酸組成，cDNA序列共有540bp(GenBank Accession#：AY607104)。本發明截取其1-297位核苷酸序列，得到截短的多 肽片段attP1的編碼基因，然后將其導入表達載體，再轉化宿主細胞得到轉 化體，培養轉化體進行表達，利用載體上附加的His-tag進行截短的多肽片 段attP1的分離純化以及western?blot驗證，最后對純化的attP1多肽進行抗 菌活性實驗。抗菌活性試驗結果表明，截短的多肽片段attP1有著與全長的 抗菌肽attacin相似的抗菌活性。

因此，本發明一種來自采采蠅(Glossina?morsitans?morsitans)抗菌肽 Attacin的多肽片段attP1，其具有序列表中SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列， 共有99個氨基酸組成。顯然，SEQ?ID?No.2是其成熟肽的氨基酸序列，根據 本發明，所說的“多肽片段attP1”當然也包括本領域技術人員所知的將SEQ ID?No.2序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代或添加且具有相 同酶活性的由其衍生的多肽或蛋白質，比如在C末端和/或N末端添加一個 或數個氨基酸，如與載體編碼的氨基酸融合、前導序列、分泌序列或用來純 化此多肽的序列或蛋白原序列等；一個或多個保守性氨基酸殘基被取代；或 成熟多肽與另一化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，如聚乙二醇)融合 所形成的多肽；也可以是一個或氨基酸殘基中具有取代基團的多肽。

其次，本發明還提供一種核苷酸序列，其是下列核苷酸序列之一：

1)編碼上述多肽片段attP1的cDNA，可以是抗菌肽Attacin第1-297位 核苷酸序列，如序列表中SEQ?ID?No.1所示；

2)與核苷酸序列1)完全互補的核苷酸序列。

再者，本發明還提供包括上述核苷酸序列的表達載體；優選地，該表達 載體是由所述核苷酸序列連接于質粒pET28a構成的質粒pET28a-attP1。