[發(fā)明專利]一種精子熒光染色測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710040709.4
• 申請日: 2007-05-16
• 公開（公告）號: CN101308131A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 施惠娟;王健;袁瑤;趙洪鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市計劃生育科學研究所
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 徐迅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及熒光染色，尤其涉及核酸染色，更涉及精子熒光染色。

背景技術(shù)

精子密度、精子膜完整性以及精子的運動狀態(tài)是臨床男科實驗室評估精液質(zhì)量的最常用的指標。使用計算機輔助精子分析(CASA)可以較精確的提供精子動力學的量化數(shù)據(jù)，但目前臨床上用的CASA不能用于精子密度的檢測，因為它難以將精子從非精子的顆粒碎片中區(qū)分開來。CASA系統(tǒng)的另一個缺點是不能區(qū)分不動的精子和死精子，特別是需輔助生殖治療的男性患者，如果不動精子(D級)的百分數(shù)超過50％，則應檢測精子的存活率，而且存活率評估可核查精子活力評估的準確性。

精子存活率檢測最常用的是伊紅染色和精子尾部低滲膨脹試驗，兩種方法最大的缺點是重復性差，不同實驗室間的結(jié)果差異很大，而且操作過程中，對精子的活率有顯著的影響，有的精子甚至已經(jīng)不動了。

因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種熒光染色方法，它能準確區(qū)分死細胞和活細胞，對非細胞成分拒染，同時又沒有細胞毒性，即染料的加入不影響細胞正常的生命活動，那么DNA熒光染色CASA代替現(xiàn)有的CASA指日可待了。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種精子熒光染色測定方法。

本發(fā)明的另一個目的是提供染料碘化丙啶(PI)和Transgreen在精子熒光染色測定中的用途。

本發(fā)明的再一個目的是提供一種試劑盒，用于精子存活率熒光染色測定。

在本發(fā)明的第一個方面，提供了一種精子熒光染色測定方法，它包括步驟：

(1)將精子、菲啶類染料和花菁類染料混合，得到混合溶液，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；花菁類染料選自Transgreen；

(2)測定混合溶液中精子的熒光值。

在另一優(yōu)選例中，它包括步驟：

(1)將精子、碘化丙啶和Transgreen混合，得到混合溶液；

(2)計數(shù)混合溶液中綠色精子和/或紅色精子的個數(shù)，其中綠色精子是活精子，紅色精子是死精子。

在另一優(yōu)選例中，計數(shù)混合溶液中大于等于200個精子中綠色精子的個數(shù)。

在另一優(yōu)選例中，混合溫度為20-37℃，更佳地為30-37℃。

在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(1)為：將精子和碘化丙啶混合3-15分鐘后，加入Transgreen，得到混合溶液。

在另一優(yōu)選例中，精子和碘化丙啶混合5-10分鐘，更佳地，為4-9分鐘。

在另一優(yōu)選例中，加入Transgreen混合5-20分鐘，進行步驟(2)的測定。更佳地，加入Transgreen混合3-10分鐘。

在另一優(yōu)選例中，精子和碘化丙啶混合的溶液濃度為12-48uM。

在另一優(yōu)選例中，精子和碘化丙啶混合的溶液濃度為18-36uM，更佳地，為21-30uM。

在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(1)為：將精子和Transgreen混合3-15分鐘后，加入碘化丙啶，得到混合溶液。

在另一優(yōu)選例中，精子和Transgreen混合5-10分鐘，更佳地，為4-9分鐘。

在另一優(yōu)選例中，加入碘化丙啶混合2-10分鐘，進行步驟(2)的測定。更佳地，加入碘化丙啶混合3-7分鐘。

在另一優(yōu)選例中，精子和Transgreen混合的溶液濃度為50-200nM。

在另一優(yōu)選例中，精子和Transgreen混合的溶液濃度為75-150nM，更佳地，為90-120nM。

在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(1)為：將精子、碘化丙啶和Transgreen一起加入，得到混合溶液。

在另一優(yōu)選例中，精子、碘化丙啶和Transgreen一起加入后混合10-30分鐘，較佳地為10-20分鐘，更佳地為15-20分鐘。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種菲啶類染料和花菁類染料形成的復合染料的用途，所述的復合染料用于精子存活率熒光染色測定。

在另一優(yōu)選例中，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；花菁類染料選自Transgreen。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種試劑盒，它含有：

(a)菲啶類染料，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；和

(b)花菁類染料，所述的花菁類染料選自Transgreen。

據(jù)此，本發(fā)明提供了一種熒光染色方法，它能準確區(qū)分死細胞和活細胞，對非細胞成分拒染，同時又沒有細胞毒性，即染料的加入不影響細胞正常的生命活動。

附圖說明

圖1顯示了Transgreen染料和PI染料對精子運動參數(shù)的影響，即各組在不同時間測定的活率；其中