[發(fā)明專利]一種豹皮香菇0820菌種的分子特異標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710040330.3
• 申請日: 2007-04-29
• 公開（公告）號(hào): CN101089194A
• 公開（公告）日: 2007-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚琦;陳明杰;尚曉冬;宋春艷;秦蓮花;潘迎捷
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所
• 代理人: 黃志達(dá);謝文凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豹皮香菇0820菌種的分子特異標(biāo)記及其獲 得方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

我國香菇產(chǎn)量已從1983年的1.95萬噸迅速發(fā)展到2005年的242萬噸，占全球香 菇總產(chǎn)量的70％以上，改寫了世界食用菌產(chǎn)量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑 菇產(chǎn)量差距，有專家預(yù)測，由于中國香菇產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在近10年內(nèi)其將成為世界產(chǎn) 量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發(fā)展速度，優(yōu)質(zhì)的品質(zhì)及低廉的成本為世界菇業(yè)人 士矚目，中國香菇已風(fēng)靡世界。

優(yōu)質(zhì)菌種在香菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產(chǎn)業(yè)中的 重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國家 的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，同時(shí)也要加強(qiáng)保護(hù)我們國家自己的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品 種登記制度來真正保護(hù)我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登 記奠定基礎(chǔ)。尤其日本2004年4月1日開始實(shí)行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其 是香菇的出口構(gòu)成了極大的威脅。就國內(nèi)而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的 現(xiàn)象，不僅給菇農(nóng)帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香 菇的快速發(fā)展；而且，隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對香菇栽培菌株質(zhì)量的要求 越來越高，需要發(fā)展更為簡便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準(zhǔn)確 無誤。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分子標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為 發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)提供了有效手段。SCAR(Sequence?Characterized Amplified?Region)標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低成本 的特點(diǎn)，本發(fā)明建立了豹皮香菇0820菌種的SCAR分子標(biāo)記，能對豹皮香菇0820菌種進(jìn) 行快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了能對豹皮香菇0820菌種進(jìn)行簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定和檢測， 提供了一種豹皮香菇0820菌種的分子標(biāo)記，同時(shí)提供了這種豹皮香菇0820菌種的分子標(biāo) 記的獲得方法。

本發(fā)明提供的一種豹皮香菇0820菌種的分子特異標(biāo)記為400bp大小的特異片段，其 特異性PCR擴(kuò)增引物對序列為：?5′TGGCATGAGCATCTGGTCTG3′和 5′CGTATCGTTTAGGAAGGGTG3′。

本發(fā)明提供的一種豹皮香菇0820菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，包括下列步驟：

(1)菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取。

(2)香菇菌株豹皮香菇0820菌株的特異DNA片斷的獲得：

采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩選試驗(yàn)，在采用簡單重復(fù)序列為引物獲得了香菇菌株507 的特異DNA片斷，將該片段克隆測序。

(3)特異PCR擴(kuò)增引物的獲得：

以得到的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，引物對的序列如下： 5′TGGCATGAGCATCTGGTCTG3′和5′CGTATCGTTTAGGAAGGGTG3′。

(4)用特異PCR擴(kuò)增引物對對豹皮香菇0820菌株進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增。

(5)電泳檢測可見400bp大小的特異片段(圖1)。而其它香菇菌種均未見特異性片斷。

對114(為生產(chǎn)用種)個(gè)收集自全國各地的香菇生產(chǎn)用菌種及少數(shù)野生種共164個(gè)菌 株進(jìn)行SCAR擴(kuò)增。164個(gè)菌種中有豹皮香菇0820菌株具有專一擴(kuò)增條帶。

根據(jù)采用這一對特殊引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以能否產(chǎn)生400bpDNA片段作為對豹皮香菇 0820菌株進(jìn)行鑒定和檢測的依據(jù)。

該檢測方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確性 高的優(yōu)點(diǎn)。該檢測所需時(shí)間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí) 間，出菇試驗(yàn)則需要至少3個(gè)月的時(shí)間；該方法在所收集的我國164個(gè)香菇生產(chǎn)菌株中具 有豹皮香菇0820菌株的專一性。

附圖說明

圖1豹皮香菇0820菌株專用檢測引物對香菇菌株進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增結(jié)果