[發明專利]香菇申香93菌種的分子特異標記及方法與應用

無效

• 申請號: 200710040325.2
• 申請日: 2007-04-29
• 公開（公告）號: CN101086019A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 宋春艷;譚琦;陳明杰;尚曉冬;潘迎捷
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院食用菌研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.一種香菇申香93菌種的分子特異標記，其特征在于：特異性PCR擴增引物對序列為5’TCTGTTGCTCCTATTGC?3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA?3’；DNA片斷大小為540bp。

2.一種香菇申香93菌種的分子特異標記的獲得方法，其特征在于：包括如下步驟：

a.菌絲培養和基因組DNA的提取

將低溫保藏的香菇菌種轉接到PDA斜面上，25℃培養活化，收集菌絲，用改進的CTAB法提取基因組DNA；

b.香菇申香93菌株的特異DNA片斷的獲得

采用PCR技術，經過大量的篩選試驗，在在采用隨機引物獲得了香菇菌株申香93的特異DNA片斷，分子量為553bp，將該片段克隆測序；

c.特異PCR擴增引物的獲得

以得到的DNA序列為基礎，設計特異PCR擴增引物，引物對的序列如下：5’TCTGTTGCTCCTATTGC?3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA?3’；

d.用特異PCR擴增引物對對香菇申香93菌株菌株進行SCAR-PCR擴增

為了排除其它菌種的假陰性情況，在SCAR-PCR反應體系中加入ITS(InternalTranscribed?Spacer)通用引物對(ITS1、ITS4)，驗證所有模板DNA的完整性；

e.電泳檢測

電泳檢測可見香菇申香93菌株能擴增出540bp大小的特異片斷。

3.如權利要求2所述的一種香菇申香93菌種的分子標記的獲得方法，其特征在于：步驟

b所用隨機引物序列為：TGCGCCCTTC。

4.如權利要求2所述的一種香菇申香93菌種的分子標記的獲得方法，其特征在于：步驟a中菌絲培養條件為將低溫保藏的香菇菌種轉接到PDA斜面上，25℃培養活化，兩周后接到100mL?PD液體培養基中，25℃100r/min振蕩培養兩周；所提取DNA稀釋至20ng/μL。

5.如權利要求2所述的一種香菇申香93菌種的分子特異標記的獲得方法，其特征在于：所述步驟d中的SCAR-PCR擴增：擴增體系總體積為：25μL，擴增體系：10×PCR?buffer2.5μL，25mmol/L?MgCL₂?2μL，10mmol/L?dNTP?0.25L，2.5U/μL?Taq?DNA酶0.5μL，10μmol/L香菇申香93菌株檢測專用引物對各1μL，模板DNA?1μL(濃度1ng～10ng/μL)，ddH₂O?18.6μL，PCR反應條件：94℃?1min；94℃?15second，61℃?15second，72℃?1min，30個循環；72℃?5min。

6.如權利要求2所述的一種香菇申香93菌種的分子特異標記的獲得方法，其特征在于：所述步驟e電泳檢測為：取步驟d?PCR擴增產物8μL，與1μL加樣緩沖液混勻，點樣于1.5％的瓊醋糖凝膠上，于0.5?X?TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。

7.一種香菇申香93菌種的分子特異標記應用于香菇申香93菌種的快速鑒定和檢測。