[發明專利]一種香菇45菌種的分子特異標記及其獲得方法與應用

無效

• 申請號: 200710040319.7
• 申請日: 2007-04-29
• 公開（公告）號: CN101086015A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 宋春艷;譚琦;陳明杰;尚曉冬;潘迎捷
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院食用菌研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種香菇45菌種的分子特異標記及其獲得方法與應用。

背景技術

我國香菇產量已從1983年的1.95萬噸迅速發展到2005年的242萬噸，占全球香菇總產量的70％以上，改寫了世界食用菌產量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產量差距，有專家預測，由于中國香菇產業的迅猛發展，在近10年內其將成為世界產量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發展速度，優質的品質及低廉的成本為世界菇業人士矚目，中國香菇已風靡世界。

優質菌種在香菇單產和質量中的貢獻率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產業中的重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種知識產權，同時也要加強保護我們國家自己的品種知識產權，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產權，必須首先建立成熟的品種鑒定技術，為新品種登記奠定基礎。尤其日本2004年4月1日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構成了極大的威脅。就國內而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現象，不僅給菇農帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發展；而且，隨著大規模的工廠化栽培方式的出現，對香菇栽培菌株質量的要求越來越高，需要發展更為簡便、快速、準確的菌株鑒定技術，以保證每批次的用種都準確無誤。

隨著分子生物學技術的快速發展，特別是分子標記和基因標記技術的建立與成熟，為發展簡便、快速、準確的菌株鑒定技術提供了有效手段。SCAR(Sequence?CharacterizedAmplified?Region)標記是一種十分穩定的分子標記，在應用上具有迅速、簡便、低成本的特點，本發明建立了香菇45菌種的SCAR分子標記，能對香菇45菌種進行快速鑒定。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是為了能對香菇45菌種進行簡便、快速、準確的鑒定和檢測，提供了一種香菇45菌種的分子特異標記，同時提供了這種香菇45菌種的分子特異標記的獲得方法。

本發明提供的一種香菇45菌種的分子特異標記為604bp大小的特異片段，其特異性PCR擴增引物對序列為：5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA?3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG?3’。

本發明的一種香菇45菌種的分子特異標記的獲得方法，包括下列步驟：

(1)菌絲培養和基因組DNA的提取：

將低溫保藏的香菇菌種轉接到PDA斜面上，25℃培養活化。兩周后接到100mL?PD液體培養基中，25℃100r/min振蕩培養兩周，收集菌絲，用改進的CTAB法提取基因組DNA香菇。

(2)菌株45的特異DNA片斷的獲得：

采用PCR技術，經過大量的篩選試驗，在采用隨機引物(引物序列：TGCGCCCTTC獲得了香菇菌株45的特異DNA片斷，分子量為613bp，將該片段克隆測序。

(3)特異PCR擴增引物的獲得：

以得到的DNA序列為基礎，設計特異PCR擴增引物，引物對的序列5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA?3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG?3’。

(4)用特異PCR擴增引物對對45菌株進行SCAR-PCR擴增。

擴增體系總體積為：25μL，10×PCR?buffer?2.5μL，25mmol/L?MgCL₂?2μL，10mmol/LdNTP?0.25L，2.5U/μL?Taq?DNA酶0.5μL，10μmol/L?45菌株檢測專用引物對各1μL，模板DNA?1μL(濃度1ng～10ng/μL)，ddH2O?18.6μL。PCR反應條件：94℃?1min；94℃15second，61℃?15second，72℃?1min，30個循環；72℃5min。

(5)電泳檢測可見604bp大小的特異片段(圖1)。而其它香菇菌種均未見特異性片斷。

對114(為生產用種)個收集自全國各地的香菇生產用菌種及少數野生種共164個菌株進行SCAR擴增。164個菌種中只有45菌株擴增出分子量為604bp的專一擴增條帶。

根據采用這一對特殊引物進行PCR擴增，以能否產生604bpDNA片段作為對香菇45菌株進行鑒定和檢測的依據。

該檢測方法與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高的優點。該檢測所需時間只需要2-3天，而常規的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少3個月的時間。

附圖說明