[發(fā)明專利]一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶的快速提純方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710040318.2
• 申請(qǐng)日: 2007-04-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101130767A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱利民;柴艷倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/12
• 分類號(hào): C12N9/12
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所
• 代理人: 黃志達(dá);謝文凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于一種提純方法，具體涉及一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶的快速提純方法。

背景技術(shù)

脫氧胞苷激酶(dCK)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的四大激酶之一，它廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)及一些細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞體內(nèi)，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷類藥物的磷酸化^[1]~[4]。研究表明，抗病毒核苷類藥物在人體內(nèi)通過(guò)dCK催化進(jìn)行磷酸化，產(chǎn)生與逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合的底物，而發(fā)揮藥效。但是，在一些患者體內(nèi)細(xì)胞的dCK含量很低，無(wú)法催化核苷類藥物的磷酸化，因而導(dǎo)致了病毒的抗藥性^[5]。因此，對(duì)核苷類藥物進(jìn)行體外磷酸化，是近年來(lái)核苷類藥物研究的一大方向。傳統(tǒng)的小牛胸腺dCK的提純主要分為粗提和柱層析兩步。所謂粗提就是將小牛胸腺粉碎勻漿，再對(duì)勻漿液進(jìn)行鹽析，透析后得dCK粗酶。將得到的dCK粗酶進(jìn)行多次柱層析，就可得精提的dCK了^[6]。該方法的缺點(diǎn)在于柱層析過(guò)程較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，重復(fù)性不高，容易導(dǎo)致dCK的失活和較大的實(shí)驗(yàn)誤差。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服了傳統(tǒng)的小牛胸腺dCK的提純方法的繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)、易使dCK的失活和較大的實(shí)驗(yàn)誤差的缺陷，提供了一種快速、簡(jiǎn)便、所提dCK活性較好的小牛胸腺dCK的提純方法。

本發(fā)明提供的是一種利用先進(jìn)的快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)快速提純小牛胸腺dCK的方法，包括如下步驟：對(duì)小牛胸腺進(jìn)行粉碎勻漿、鹽析、透析提取dCK粗酶；再利用FPLC的分子篩凝膠柱和離子交換柱層析對(duì)上述dCK粗酶進(jìn)行分離純化。

具體步驟如下：

1、小牛胸腺dCK粗酶的提?。?/p>

(1)將小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎儀中與0.001M～0.1M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM巰基乙醇，pH?6.0～7.0)一起進(jìn)行勻漿化。

(2)將上述勻漿液低溫超速離心10～20min，取上清液。向上清液中加入1％～10％鏈霉素硫酸鹽溶液進(jìn)行沉淀。

(3)將上述沉淀液低溫超速離心10～20min，，取上清液。向上清液中加入10％～30％的硫酸銨進(jìn)行沉淀。

(4)將上述沉淀液低溫超速離心10～20min，取上清液。向上清液中加入硫酸銨10％～20％進(jìn)行沉淀。

(5)將上述沉淀液低溫超速離心10～20min，留取沉淀物。用少量0.001M～0.1M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM巰基乙醇，pH6.0～7.0)溶解沉淀。

用0.001M～0.1M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM巰基乙醇，pH6.0～7.0)對(duì)上述溶解液進(jìn)行透析40小時(shí)以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。

2、FPLC提純小牛胸腺dCK

(1)分子篩凝膠層析。將上述粗酶液在FPLC系統(tǒng)中層析，條件是：分子篩凝膠柱：Sephodex?G75；洗脫液：0.001M～0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM巰基乙醇pH6.0～7.5)；平衡：2個(gè)柱床；洗脫：1～2個(gè)柱床；流速：0.25～0.75ml/min。所得的鋒譜圖如圖1。

(2)離子交換層析。將上述粗酶液在FPLC系統(tǒng)中用離子交換柱進(jìn)行分離，條件是：離子交換柱：HiTrip?Q?FF?1ml；洗脫液A：0.001M～0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM巰基乙醇，pH?6.0～7.5)；洗脫液B：0.001M～0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM巰基乙醇，pH?9.0～10.0)+1M～2M的NaCl；平衡：10～25個(gè)柱床；沖洗：2～5個(gè)柱床；洗脫梯度：洗脫液B在5～10個(gè)柱床內(nèi)保持3％～7％，然后在5個(gè)柱床內(nèi)保持10％～15％，然后在5～10個(gè)柱床內(nèi)保持20％～25％，然后在5～10個(gè)柱床內(nèi)保持40％～50％；流速：0.75～1ml/min。陰離子交換層析得到三個(gè)峰，分別是流穿峰，A峰、B峰和C峰，所得的峰譜圖如圖2。

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和HPLC酶活表征：

(1)SDS-PAGE凝膠電泳：將陰離子層析和分子篩凝膠層析得到的收集峰進(jìn)行電泳表征。其中分子篩凝膠層析經(jīng)過(guò)電泳后得到三條條帶；陰離子交換層析得到一條條帶。條件是：分離膠濃度為7％～15％；濃縮膠濃度為4％～5％；電流為10～15mA(濃縮膠)、20～30mA(分離膠)；電泳時(shí)間為40～80min，電泳槽：Ready?Gel?Precast?Gel?System(Bio-Rad)。電泳圖見(jiàn)圖3。