[發明專利]GST－hDSL重組蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 200710039991.4
• 申請日: 2007-04-26
• 公開（公告）號: CN101063127A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 韓偉;郭凌晨;黃薇薇;趙梅
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N1/21;C07K19/00
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;張宗明

1、一種GST-hDSL重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步，構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL；

第二步，誘導表達重組表達質粒pGEX-2T-hDSL；

第三步，將表達產物依次經變性，復性，離心，沖洗，洗脫后純化得到GST-hDSL重組蛋白的。

2、如權利要求1所述的GST-hDSL重組蛋白的制備方法，其特征是，所述第一步構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL，具體包括如下步驟：

a.以上游5’-cgggatccctccacacagattctcctg-3’，下游5’-cggaattcttagatcggctctgtgcagtag-3’為反應引物，以質粒pBlue-hDLL-1為模板，對hDSL區進行預變性，變性，退火，延伸，30個循環，最后再延伸完成聚合酶鏈式反應擴增；

b.經瓊脂糖電泳分離聚合酶鏈式反應產物；

c.割膠回收目的產物，該目的產物為hDSL序列，用限制性內切酶EcoR?I、BamH?I雙酶切目的產物和原核表達質粒pGEX-2T，含有GST結構，連接后轉化入DH5α，構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL。

3、如權利要求2所述的GST-hDSL重組蛋白的制備方法，其特征是，所述聚合酶鏈式反應的反應條件是：94℃預變性5min，94℃變性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環，最后72℃延伸10min。

4、如權利要求1所述的GST-hDSL重組蛋白的制備方法，其特征是，所述第二步誘導表達重組表達質粒pGEX-2T-hDSL中，包括具體如下步驟：

a.挑選經測序證實無突變且讀框正確的陽性克隆；

b.用上述重組表達質粒pGEX-2T-hDSL轉化大腸桿菌E.coliDH5α菌株；

c.于37℃培養至A_600nm為0.4小時～0.6小時，加入濃度為0.1mmol/L的異丙基-b-D-硫代半乳糖苷至其終，誘導表達4小時-6小時，收獲細菌。

5、如權利要求1所述的GST-hDSL重組蛋白的制備方法，其特征是，所述第三步具體包括如下步驟：

a.將表達產物以包涵體形式存在于沉淀中，將表達產物經8mol/L-10mol/L尿素、pH7-pH9變性液溶解；

b.用pH9-pH11的復性液及pH7-pH9稀釋液緩慢復性；

c.將復性所得產物離心，取上清以陰離子交換柱純化；

d.用pH7-pH9的洗脫液沖洗；

e.用0.5M-1M?NaCl洗脫，最終純化得到GST-hDSL重組蛋白。