[發(fā)明專利]一種胰島細(xì)胞體外增殖方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710038631.2
• 申請日: 2007-03-29
• 公開（公告）號: CN101054571A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李戈;盧大儒
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;A61K35/12;A61P3/10;C12N5/08
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胰島細(xì)胞的體外培養(yǎng)和增殖方法。

背景技術(shù)

糖尿病是一種由胰島素分泌相對和絕對不足導(dǎo)致的慢性代謝疾病，尤其是血糖水平的異常，晚期可導(dǎo)致腎臟、眼底、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和血管等組織器官的病變，并伴有失明、腎衰等嚴(yán)重癥狀的罹患風(fēng)險。據(jù)估計目前全球有超過1.5億人患有糖尿病，而預(yù)計在2025年糖尿病患者將達(dá)到3億。

目前糖尿病主要可分為兩種類型：一型糖尿病和二型糖尿病。前者主要是由胰島素的絕對不足引起的，而胰島素絕對量的不足則是由于人體中唯一可以分泌胰島素的細(xì)胞——胰島β細(xì)胞的嚴(yán)重不足。目前研究表明，胰島β細(xì)胞的缺失主的主要原因是T細(xì)胞對β細(xì)胞的自體免疫攻擊。二型糖尿病則的主要病因則是胰島素的靶器官(肝臟、肌肉等)對胰島不敏感，而更深層的病因較一型糖尿病更為復(fù)雜。二型糖尿病在初期只表現(xiàn)為胰島素的相對缺乏，并伴隨有應(yīng)激性的胰島增殖和高胰島素表現(xiàn)，而在晚期由于長期高血糖導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞的大量凋亡，胰島素水平也大量下降。針對以上情況，胰腺或胰島移植不僅對于一型，也是二型糖尿病目前最理想的治療方案之一。

胰腺器官移植較胰島移植開展得早，相對而言能提供更長時間的正常胰島素供給，但是胰腺器官移植手術(shù)難度高，風(fēng)險大，作為糖尿病的治療手段并不十分理想。

胰島移植世界第一例臨床胰島移植于1974年開展，受體為一位腎移植術(shù)后的糖尿病患者。全胰切除后行自體胰島移植是上世紀(jì)70年代開展的。上世紀(jì)90年代以前胰島移植的療效一直不太滿意，只有大約10％的胰島移植受體脫離了胰島素的使用。2000年7月加拿大Edmonton中心報告一套被稱為“Edmonton方案”的胰島移植方法，對連續(xù)7例有嚴(yán)重低血糖史及代謝不穩(wěn)定史的II型糖尿病患者進(jìn)行胰島移植，采用無類固醇激素的免疫抑制治療方案，移植后7名患者均實(shí)現(xiàn)了胰島素自給，為成人胰島移植的臨床應(yīng)用帶來廣闊前景。其后全世界有很多移植中心也采用“Edmonton方案”進(jìn)行成人胰島移植并取得了類似的結(jié)果，移植技術(shù)日趨成熟。臨床上胰島移植的病例越來越多，1974年至今世界上已報道的臨床胰島移植近1000例。和胰腺移植相比胰島移植具有移植程序簡單、手術(shù)安全性高的優(yōu)勢，而且即使移植失敗也不至于對受體造成嚴(yán)重傷害。

但胰島移植也面臨很多問題，其中供體缺乏是限制胰島移植普及的重要因素之一，通常情況下需要有兩到三個供體胰腺所分離的胰島方可滿足一位等待移植的糖尿病病人的需要。

為解決上述問題，一些研究者嘗試在體外或體內(nèi)將其他類型的成體細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為分泌胰島素的類β細(xì)胞，從而起到替代β細(xì)胞完成胰島移植的作用。主要涉及的細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和肝細(xì)胞等。上述轉(zhuǎn)分化過程中，體外分化經(jīng)常需要相當(dāng)復(fù)雜的誘導(dǎo)過程，并不十分適合細(xì)胞的大量擴(kuò)增，同時大多數(shù)實(shí)驗(yàn)雖然可在體外獲得比較好的效果，但誘導(dǎo)分化的細(xì)胞移植到體內(nèi)往往不能很好的維持血糖的正常水平。體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)主要集中在肝細(xì)胞向β細(xì)胞的分化，往往采用病毒轉(zhuǎn)基因的手段，在臨床的應(yīng)用方面由于涉及安全性問題，目前還不易推廣。

另一方面，雖然大量研究證明在成體中存在有胰島細(xì)胞的新生，但是新生胰島細(xì)胞的來源一直存在爭論。早期的研究認(rèn)為有胰島干細(xì)胞的存在，可能定位于胰島內(nèi)部，胰腺外分泌組織，尤其是分布于胰導(dǎo)管周圍得到了比較多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。有研究者從胰導(dǎo)管周圍分離得到導(dǎo)管細(xì)胞成功的誘導(dǎo)培養(yǎng)分泌胰島素的類胰島素細(xì)胞，移植后可有效控制糖尿病模型動物受體的血糖水平。然而最新的研究表明，成年個體新生的β細(xì)胞可能來源于已有的β細(xì)胞的增殖，而不是來源于可能存在的干細(xì)胞。因此，如何使β細(xì)胞能夠于體外擴(kuò)增，并保持或在需要的時候重新獲得β細(xì)胞的特性，便成今年糖尿病細(xì)胞治療研究的熱點(diǎn)之一。目前以有幾家實(shí)驗(yàn)室成功使β細(xì)胞體外增殖，并在一定時期誘導(dǎo)增殖細(xì)胞重獲體內(nèi)β細(xì)胞相應(yīng)的生物學(xué)功能。但上述實(shí)驗(yàn)一般都涉及一個無血清培養(yǎng)的過程，大部分需要比較復(fù)雜的處理保證其增殖獲誘導(dǎo)其分化，因此β細(xì)胞體外增殖的效率就受到了一定的影響。同時，據(jù)我們所知，迄今并無報道體外增殖的胰島細(xì)胞移植回糖尿病模型動物后可有效的恢復(fù)血糖正常水平，治療糖尿病。

在胰島細(xì)胞的體外增殖的嘗試中，有些課題組采用向β細(xì)胞中轉(zhuǎn)入病毒原癌基因維持β細(xì)胞的永生化，移植后也可起到治療糖尿病的效果，但方案面臨很大的安全問題。

因此，本領(lǐng)域需要一個更加簡單、安全、有效、適于臨床推廣的可用移植治療糖尿病的胰島細(xì)胞體外增殖方法。

發(fā)明內(nèi)容