[發(fā)明專利]用于生物合成肝素酶的培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710036928.5
• 申請日: 2007-01-29
• 公開（公告）號: CN101235356A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田永輝;陳雪;齊艷艷;趙文杰;馮軍;程睛華;林綱;薛春佳;朱裕輝;魏曉東
• 申請（專利權(quán)）人: 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/24
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所
• 代理人: 徐雁漪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基，具體說，涉及一種以肝素黃桿菌Flavobacterium?heparinum?ATCC?13125為菌種，生物合成肝素酶的培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

肝素酶能特異性地斷裂肝素和類肝素鏈上具有特定修飾的不同序列，產(chǎn)生不同的寡糖片段。肝素酶具有許多重要用途，包括體內(nèi)循環(huán)中肝素的消除，肝素精確結(jié)構(gòu)的確定，肝素抗凝機(jī)理和肝素結(jié)構(gòu)與功能的研究，制備低分子量肝素及抗腫瘤藥物等。國外報道采用肝素黃桿菌發(fā)酵生產(chǎn)肝素酶能夠達(dá)到的1,475U/L的效價，而國內(nèi)的報道也很低。其中，“肝素黃桿菌發(fā)酵產(chǎn)肝素酶的工藝優(yōu)化”一文披露，可由牛肉膏、蛋白胨、酵母粉和玉米漿等作為培養(yǎng)基的有機(jī)氮源合成肝素酶但效果并不明顯，其中采用如下培養(yǎng)配方((g/L)：葡萄糖8，氯化銨4，磷酸二氫鹽6，組氨酸0.75，甲硫氨酸0.75，氯化鎂0.5；微量鹽10^-4mol/L)可將產(chǎn)酶量比原來提高66％。但現(xiàn)有技術(shù)中，由于肝素黃桿菌發(fā)酵生物合成肝素酶的效價普遍不高，成為了制約采用發(fā)酵法規(guī)?；a(chǎn)肝素酶的主要障礙，是一個迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提高肝素黃桿菌發(fā)酵生物合成肝素酶的效價。

為此，本發(fā)明提供一種以肝素黃桿菌Flavobacterium?heparinumATCC?13125為菌種，生物合成肝素酶的培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、氨基酸和肝素，其特征在于，所述氮源由NH₄Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨組成。

本發(fā)明的獨(dú)特之處在于氮源的配方，即同時采用NH₄Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨。

所述NH₄Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨的重量百分比為4∶4～5∶2～3，優(yōu)選4∶4.6∶2.3。

所述NH₄Cl在培養(yǎng)基中濃度通常為2～5g/L，優(yōu)選濃度為3～4g/L。

所述氨基酸為L-His和L-Met，當(dāng)其濃度為0.25g/L到0.75g/L時，可以獲得較好的生長和產(chǎn)酶效果，優(yōu)選濃度為0.4g/L到0.6g/L。

所述肝素的濃度為1g/L到5g/L，優(yōu)選2g/L到3g/L。

本發(fā)明所使用產(chǎn)生肝素酶的菌種為肝素黃桿菌，菌種編號為ATCC13125，實(shí)際用于生產(chǎn)的菌株可以為自主誘變獲得的肝素酶高產(chǎn)菌株。

本發(fā)明的碳源可包括但不限于葡萄糖、半乳糖等，最優(yōu)地使用葡萄糖，在培養(yǎng)液中該碳源濃度為1％～7g/L，優(yōu)選濃度為3～5g/L。

本發(fā)明采用混合磷酸鹽為磷酸鈉鹽或者磷酸鉀鹽，濃度為3～7g/L，優(yōu)選為4～6g/L；本發(fā)明在培養(yǎng)液中添加微量元素(NaMoO₃，CuCl₂，F(xiàn)eCl₂，CoCl₂，MnCl₂，CaCl₂)，濃度為10^-3～10^-5M，最優(yōu)為10^-4M。

本發(fā)明生物合成過程中的空氣通氣量通常在0.2～1.5vvm，優(yōu)選在0.5～0.8vvm；溫度控制在23～28℃，優(yōu)選在24℃～26℃；可測得最高酶活力時間在30～36h，優(yōu)選在32～34h。

本發(fā)明在發(fā)酵過程中pH值控制在6.0～7.0，優(yōu)選為6.2～6.8。

發(fā)酵結(jié)束將細(xì)胞培養(yǎng)液離心(10,000r/min，8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、pH7.0磷酸緩沖液洗滌后懸浮細(xì)胞，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎。然后離心(14,000r/min，30min)收集上清即得無細(xì)胞粗酶。

采用本發(fā)明培養(yǎng)基配方培養(yǎng)肝素黃桿菌，菌體生長和產(chǎn)酶都優(yōu)于文獻(xiàn)所報道的培養(yǎng)基，菌體產(chǎn)量可達(dá)到15g/L(濕重)，產(chǎn)酶效價可高達(dá)2,000U/L。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1