[發(fā)明專利]提高草坪草胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710035928.3
• 申請日: 2007-10-18
• 公開（公告）號: CN101147467A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣建雄;易自力;陳智勇;艾辛;覃靜萍
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N5/04
• 代理公司: 長沙市融智專利事務(wù)所
• 代理人: 顏勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及提高草坪草胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的新方法，特別是涉及外植體的處理方法。

背景技術(shù)

草坪草(turfgrass)是指構(gòu)成草坪植被的草本植物，主要包括禾本科和少數(shù)幾種莎草科植物以及一些符合草坪草特性的其它植物，目前約有40種草坪草用于草坪建植。草坪草具有保持水土、改造自然、美化環(huán)境等功能。除城市林網(wǎng)及園林景觀，草坪是城市面積最大的綠色生命之源。為了滿足多種多樣草坪草的需求，草坪草的改良已有50多年的發(fā)展歷史。草坪草的性狀改良目前主要還是采用傳統(tǒng)的育種技術(shù)，存在比較費時、費力、困難大的明顯弱點，已經(jīng)不能滿足草坪發(fā)展的需要。而運用植物遺傳工程技術(shù)可極大縮短育種年限，加快育種進(jìn)程，且更有目的地獲得具有更理想性狀的新品種。

胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是進(jìn)行遺傳工程改良植物性狀的前提和基礎(chǔ)。首先，胚性愈傷組織可以在物理或化學(xué)方法的誘導(dǎo)下產(chǎn)生體細(xì)胞的變異，通過分化再生得到變異改良的植株。其次，在所有的外源基因受體系統(tǒng)中，胚性愈傷組織受體系統(tǒng)一直以其數(shù)量多，易再生，穩(wěn)定性好而成為首選；胚性愈傷組織成為外源優(yōu)良目的基因的受體，在外源基因轉(zhuǎn)化后分化再生得到轉(zhuǎn)基因植株。因此，提高胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率，并在此基礎(chǔ)上，建立高頻胚性愈傷組織誘導(dǎo)、再生體系顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的旨在提供一種為草坪草高頻胚性愈傷組織再生體系的建立提供基礎(chǔ)的，可提高草坪草胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的方法。

本發(fā)明的目的是通過下述方式實現(xiàn)的：

1)將成熟種子無胚的一端切除，以胚端的半粒種子為外植體，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；

2)將材料放置于25±2℃，黑暗培養(yǎng)；每隔20天左右更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基；25±2℃，黑暗培養(yǎng)；所述新鮮培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；

3)待愈傷組織長到直徑為2至5mm大小時，及時將穎殼及胚芽切除，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每隔20天左右更換一次繼代培養(yǎng)基25±2℃，黑暗培養(yǎng)至出愈數(shù)不再增加。

所述的消毒處理是將成熟胚經(jīng)75％酒精消毒1min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用無菌水沖洗4～5次，晾干。

所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為2-8mg/l。

所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還含有濃度為300mg/l的水解酪蛋白和500mg/l的脯氨酸，或者含有濃度為25g/l的甘露糖。

愈傷組織色澤鮮黃顆粒狀為好。

自從運用植物遺傳工程技術(shù)對草坪草品質(zhì)進(jìn)行改良以來，有關(guān)其胚性愈傷組織再生體系的建立、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立都有了十分廣泛的研究。但在一些種的草坪草中，一直存在胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低的問題，而且，就將成熟種子無胚的一端切除，提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率還未見報道。

本發(fā)明具體實施過程為：

1.將成熟種子無胚的一端切除，以胚端的半粒種子為外植體，經(jīng)75％酒精消毒1min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用無菌水沖洗4至5次，晾干后接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加了水解酪蛋白、脯氨酸、甘露糖和2，4-D，每隔20天左右更換一次新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

2.待愈傷組織長到直徑為2至5mm大小時，及時將穎殼及胚芽切除，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每隔20天左右更換一次新鮮繼代培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基的成份與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)在黑暗條件下進(jìn)行，全部培養(yǎng)過程的溫度都控制在25±2℃左右。

3.自接種后，每天觀察材料，每三天作一次紀(jì)錄，紀(jì)錄內(nèi)容包括愈傷組織最初出愈時間、出愈數(shù)目、愈傷組織色澤和形態(tài)；25±2℃，黑暗培養(yǎng)至出愈數(shù)不再增加，最后記錄每三角瓶中愈傷組織出愈數(shù)。

愈傷組織誘導(dǎo)率＝(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100％

在上述過程中用到的水解酪蛋白的濃度為300mg/l；脯氨酸的濃度為500mg/l；甘露糖的濃度為25g/l；2，4-D的濃度為2至8mg/l。

具體實施方式

實施例1、提高草地早熟禾的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的新方法