[發明專利]一種兔抗人T淋巴細胞免疫血清的制備方法

無效

• 申請號: 200710035186.4
• 申請日: 2007-06-22
• 公開（公告）號: CN101084923A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 毛智立
• 申請（專利權）人: 岳陽博康生物技術有限公司
• 主分類號: A61K35/16
• 分類號: A61K35/16;A61K39/395;C12N5/08;A61P7/00;A61P37/06
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技術領域

本發明屬于生物制劑原料制備方法領域，具體涉及到抗人T淋巴細胞免疫血清的制備方法。

背景技術

抗人淋巴細胞免疫球蛋白(ATG)為一種生物免疫抑制劑，能與患者T淋巴細胞結合后，激活補體，抑制或除去人體內T淋巴細胞，臨床上主要用于組織器官移植排異反應、急性再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血、原發性血小板減少性紫癜及其他惡性免疫疾病的治療，市場需求量每年不低于200萬支，具有廣闊的市場前景。

目前，國內ATG的制備方法為：使用人胸腺淋巴細胞作免疫原，免疫豬后得到抗人淋巴細胞免疫球蛋白制品原料血清，該原料經提純、精制等工藝后成為豬抗人淋巴細胞免疫球蛋白制劑。該方法采用的人胸腺淋巴細胞取自醫院6個月以上引產的死嬰，隨著國家計劃生育政策的改革與完善，人民計劃生育意識的提高，非正常分娩情況逐漸減少，細胞來源已經相當困難，原料不足已成為限制生產規模擴大的瓶頸。目前國內抗淋巴免疫球蛋白產品主要依賴進口，而國外產品的市場價格為4000元/支，超過國內同類產品價格的兩倍以上。因此，無論從國內患者治療成本的角度還是從中國生物產業的發展角度考慮，都應該大力發展自主品牌產品，而解決這一問題，首要問題在于解決免疫原料來源困難的問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有制備方法存在的原料來源困難的缺點，提供一種新的兔抗人T淋巴細胞免疫血清的制備方法。

為實現上述目的，本發明的方法包括：

1、細胞分離機采人外周血T淋巴細胞；

2、0.85％生理鹽水洗滌離心3次去除血小板；

3、Hank’s緩沖液稀釋，采用密度梯度離心法離心2-3次；

4、用小鼠抗人CD3單克隆抗體免疫磁株法去除B淋巴細胞，分離到T淋巴細胞；

5、T淋巴細胞的傳代培養5-6代；

6、收集T淋巴細胞計數并檢查活率；

7、分三次進行動物免疫，采血并分離血清；

8、按《中華人民共和國藥典三部》的檢測方法相關檢測。

本發明的優點在于：

1、應用本發明的方法可以走出胸腺原料不足的瓶頸，擴大生產規模。

2、外周血T淋巴細胞培養制備的免疫原，在進行免疫時所需要的免疫量低于胸腺細胞的免疫量，能顯著降低生產成本。

3、應用本發明的方法純化的T淋巴細胞收率達到87％以上，純度達到95％以上，以其作抗原制備的兔抗人T淋巴細胞免疫血清在細胞毒、玫瑰花環抑制實驗等效價測定中，結果均超過了《中華人民共和國藥典三部》規定所需達到的效價，而在抗人紅細胞抗體與抗人血小板抗體等雜抗體的檢測中，結果均低于中國生物制品規程中所要求的水平，該方法節省了大量的人力物力，大大降低了生產成本。

具體實施方式

實施例一：采用人胸腺T淋巴細胞免疫兔制備免疫血清。

收集6個月以上流產胚胎，無菌條件下進行胸腺分離，將離體胸腺用Hnak’s緩沖液洗滌后輕輕研磨，分散胸腺細胞并去除脂肪，收集胸腺細胞并計數，按1×10⁶每毫升接種，培養基中加入可誘導胸腺細胞分化成成熟T淋巴細胞的各種細胞因子，待胸腺細胞中95％以上分化成成熟T淋巴細胞時開始收集細胞并計數，將成熟T淋巴細胞接種于含有各種刺激因子的外周血培養基，細胞接種量為1×10⁶每毫升，培養并進行傳代，共傳6代，收集T淋巴細胞免疫新西蘭兔，免疫分3次進行，免疫時間為70天，三次免疫劑量分別為5×10⁷、1×10⁸、1×10⁸個細胞，采集免疫血清進行細胞毒實驗、玫瑰花實驗以及抗紅細胞抗體滴度、抗血小板抗體滴度檢測，檢測結果見表1。采集檢測合格的動物血清，混合后重新進行以上指標的檢測，檢測合格樣品-20℃凍存備用。

??????????????????????表1常規方法制備的免疫血清檢測指標