[發明專利]一種高效表達病毒基因dsRNA的載體及其應用

無效

• 申請號: 200710034931.3
• 申請日: 2007-05-16
• 公開（公告）號: CN101067137A
• 公開（公告）日: 2007-11-07
• 發明（設計）人: 張德詠;劉勇;朱春暉;羅源華;成飛雪
• 申請（專利權）人: 湖南省植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/33;C12N1/21
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所
• 代理人: 陳暉

技術領域

本發明涉及一種載體，具體涉及高效表達病毒基因dsRNA的載體。

背景技術

植物病毒作為一類侵染植物的主要病原物，在全世界范圍內引起農作物、果樹、花卉、牧草、藥用植物的病害，造成產量和品質的下降，甚至形成毀滅性危害。據不完全統計，全世界每年因植物病毒病害所造成的產量損失就大約占糧食總產量的10％。但目前生產上仍無有效的防控方法。

RNA沉默(RNA?silencing)是指發生在RNA水平的基于核酸序列特異性的相互作用來抑制基因表達的一種調控機制，這種機制廣泛存在于真核生物中，包括真菌、藻類、植物、原生動物、無脊椎動物和脊椎動物等(Agrawal?N，Dasaradhi?PVN，Mohmmed?A，Malhotra?P，Bhatnagar?RK，and?Mukherjee?SK.RNA?interference：bilology，mechanism，and?applications.Microbiol?Mol?Biol?Rev?2003，67：657-685)，也是植物固有的一種對抗病毒侵染的普遍防衛反應(Baulcombe?D.RNA?silencing?in?plants.Nature?2004，431：356-363)。病毒在自然侵染下能誘導植株的RNA沉默，而且它能通過特定序列信號傳導到臨近細胞(短距離)和整株植物(長距離)。植物中的RNA沉默具有適應性廣，能移動和序列特定的特點。RNA沉默現象的發現為設計新的植物病毒防治方法提供了新的可能。

目前RNA沉默已經廣泛應用于基因功能研究、動物病毒病的防治和人類病毒的治療(Dykxhoorn?DM?and?Lieberman?J.Silencing?Viral?Infection.PLoS?Med?2006，3：1000-1004)，與RNA沉默應用于動物病毒的防治相比，基于RNA沉默的植物病毒防治的研究進展緩慢，近年來才引起科學家的重視。植物病毒和動物病毒有很多共性機制(如復制過程)，借鑒動物病毒的研究方法和體系，對利用RNA沉默防治植物病毒的關鍵問題進行研究，是植物病毒防治的新思路，也必將成為植物抗病毒工程研究領域的熱點(Tenllado?F，LlaveC，and?Diaz-Ruiz?JR.RNA?interference?as?new?biotechnological?tool?for?the?control?ofvirus?disease?in?plants.Virus?Res?2004，102：85-96)。

近年來，已有一些研究小組開始利用RNA沉默機制來進行植物抗病毒研究。有兩條途徑可實現dsRNA的大量表達，從而誘導植物抗病毒RNA沉默機制的啟動。1、構建表達病毒基因dsRNA的轉基因植物；2、離體表達病毒基因dsRNA。因為表達dsRNA的轉基因植物不表達蛋白質，這既提高了轉基因植物的抗病性，又避免了人們對轉基因植物安全性的顧慮。理論上，病毒基因組上的任何基因都可以用來構建能表達dsRNA的載體進行植物基因轉化，并通過該機制使轉化植物對相關病毒產生抗性。但由于大部分農作物的轉化體系不成熟，利用構建表達dsRNA載體進行植物基因轉化獲得的抗病毒轉基因植株被成功應用生產的實例并不多。而且由于作物一般均遭受多種病毒復合侵染危害，必須將不同病毒的dsRNAs轉入寄主植物才能獲得抗多種病毒的轉基因植物，而這在遺傳學上是很難實現的。

借鑒動物中所用的外源dsRNA沉默基因方法，利用離體表達的病毒基因dsRNA誘導植物RNA沉默防治病毒病可避免上述諸多缺點。目前構建能表達病毒基因dsRNA的原核表達載體包括：1、構建含有該基因反向重復序列的載體；2、利用Timmons&Fire等構建含有兩個方向相反的雙向T7啟動子的載體L4440(Specific?interference?by?ingesteddsRNA.Nature，1998，395：854)。但兩種方法生產dsRNA均需要通過誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導，而IPTG價格昂貴，限制其在農業生產上的進一步推廣。

因此構建一種既能表達病毒基因dsRNA，又無需誘導劑的原核表達載體，是實現病毒基因dsRNA的離體高效表達，誘導寄主RNA沉默的關鍵技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能高效表達病毒基因dsRNA的原核載體，從而實現利用RNA沉默防治植物病毒病害。