[發明專利]鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法

無效

• 申請號: 200710032914.6
• 申請日: 2007-12-27
• 公開（公告）號: CN101196521A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發明（設計）人: 向軍儉;王建華;唐勇;黃峙;鄧寧;王宏;楊紅宇
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于包括如下步驟：分別將魚貝類樣品提取液和系列濃度的鎘離子標準液加入到抗原預包被條的微孔中，再加入抗鎘離子的單克隆抗體到每個微孔，混勻孵育，在每個微孔中加入HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，孵育；經底物顯色后終止反應，用酶標儀測定各微孔的吸光度，對照標準品所得的曲線回歸方程，計算樣品中鎘離子的含量。

2.根據權利要求1所述的一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)在抗原預包被條的每個微孔內分別均加入10μl的100mM?EDTA，然后在上述每個微孔中再分別加入80μl魚貝類樣品提取液及80μL系列濃度的Cd²⁺標準液，混勻；然后每個微孔加入10μL?1∶32000倍稀釋的抗鎘離子的單克隆抗體；混勻，37℃孵育0.5～2h；然后用洗滌液洗滌微孔；

(2)每個微孔加入100μL用稀釋液1∶4000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育0.5～1h；然后用洗滌液洗滌微孔；

(3)每個微孔加入100μL顯色液TMB底物工作液，反應10～20min；

(4)每個微孔加入50μL終止液2M?H₂SO₄終止反應，并振蕩混勻；

(5)用酶聯讀數儀測定在450nm波長下的吸光度；

(6)將所得標準液和樣品吸光度值除以0標準的吸光度值再乘以100％，以此標準液計算值為縱坐標，鎘離子濃度的對數為橫坐標繪制標準曲線；根據每個樣品的B/B₀值從標準曲線上讀出對應的鎘離子濃度，再乘以相應的稀釋倍數，計算出樣品中實際的鎘離子濃度；所述稀釋液及洗滌液均為PBS-T即含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液。

3.根據權利要求2所述的一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于：所述魚貝類樣品提取液按下述方法預處理：每克魚肉或貝肉樣品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎勻質；4000rpm/min離心10min，取上清在50℃水浴下氮氣流吹干樣品；以等體積環己烷和蒸餾水混合提取渦漩1min，取環己烷層，每克樣品加入12.5μL?1M?HCl，再渦漩1min，靜置30min；加入2倍HCl體積量的蒸餾水，8000rpm/min，棄去上層環己烷，吸取下層清液，用1N?NaOH調整到pH7.0～8.0，用稀釋液稀釋10倍后，即得魚貝類樣品提取液。

4.根據權利要求2所述的一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于：所述抗原預包被條是按下述方法制備的：

(1)包被：用包被緩沖液即pH9.6的0.05M碳酸鈉緩沖液將Cd-iEDTA-BSA稀釋至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板孔中，4℃包被過夜或37℃包被2～3h；所述Cd-iEDTA-BSA是用iEDTA將鎘離子偶聯到載體蛋白BSA上獲得的；

(2)洗滌：倒出微孔板孔中包被緩沖液后，將200μl洗滌液加入每個微孔中；3～5分鐘后再次倒出孔中的液體，完全除去微孔中的液體；所述洗滌液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液；

(3)封閉：在微孔板每微孔加入150～200μL含0.5％～3％BSA的0.01MPBS，37℃封閉0.5h～1.5h；

(4)按步驟(2)洗滌微孔3～5次；

(5)加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時；

(6)干燥：微孔板干燥后，即得到抗原預包被條。

5.根據權利要求2所述的一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于所述抗鎘離子的單克隆抗體按下述方法制備而成：用iEDTA將鎘離子偶聯到血藍蛋白上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩定分泌抗鎘離子單克隆抗體的陽性細胞株并擴大培養，注射細胞進小鼠體內誘生腹水，純化獲得抗鎘離子的單克隆抗體。