[發明專利]蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 200710032833.6
• 申請日: 2007-12-26
• 公開（公告）號: CN101215597A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 張淑紅;吳清平;張菊梅;郭偉鵬
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/085
• 代理公司: 廣州科粵專利代理有限責任公司
• 代理人: 余炳和

技術領域

本發明發明涉及一種微生物的檢測方法，具體地說，涉及一種利用微生物的特異性酶對微生物進行快速檢測鑒定的試劑盒及檢測方法。

背景技術

“民以食為天”，食品食人類賴以生存的物質基礎，食品安全是關系人類健康和社會發展的重大問題。近年來，國內外食品安全的惡性事件不斷發生，尤其以沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌等引起的食源性疾病最為突出。據統計，發達國家每年約有1/3的人患食源性疾病，美國每年約有7600萬例食原性疾病患者，食源性疾病已成為國內外普遍關心的問題。

蠟樣芽孢桿菌是一種常見的食源性致病菌，自然界中分布甚廣，常存在于食品、海產品、空氣和水中，極易在食品加工、運輸、貯存、銷售過程中通過不衛生的原料、用具和手污染。我國近兩年食源性疾病監測網的資料顯示，蠟樣芽孢桿菌是僅次于致病性大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌的又一重要致病菌。據調查，米飯、肉類制品、乳制品、蔬菜、水果的帶菌率高達20％-77％。蠟樣芽孢桿菌食物中毒在國外早有報道。近些年，我國各地也間有報道，并呈現上升趨勢，中毒事件以在學校集體食堂、家庭、飲食服務單位等地發生居多。

目前認為蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒主要由該菌產生的腸毒素所致，其次是該菌感染，菌量和毒素量成正比。蠟樣芽孢桿菌有產毒素和不產毒素兩類，前者在適宜條件下會產生腸毒素，腸毒素又分為耐熱性嘔吐型和不耐熱性腹瀉型之分，前者主要在米飯類食品中形成，食后引起嘔吐型腸胃炎，后者則在各種食物中均可產生，食后致腹瀉型腸胃炎。我國引起食物中毒的食品大多與米飯或淀粉類制品有關，而在歐美一些國家大多由甜點心、肉餅、色拉等引起。嘔吐型腸胃炎潛伏期一般僅數小時，癥狀有惡心、嘔吐、頭暈等，腹瀉型腸胃炎一般發作在食后10-12小時，以腹痛、腹瀉癥狀為主，偶有嘔吐及發熱。蠟樣芽孢桿菌食物中毒有一定的季節性，以6-10月份居多，夏季最高，春秋次之。由于該菌污染食品后主要分解糖類，而食品沒有明顯的腐敗變質現象，除有時稍有發粘、口味不爽外，感觀基本正常，因此誤食中毒的幾率較大。

在檢測手段上，目前國內外檢測機構仍主要采用FDA、AOAC、ISO、GB等標準對蠟樣進行檢測，包括甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)分離培養、鏡檢觀察、生化鑒定等多個步驟，整個過程一般需要3-5天，且操作復雜，已不能滿足微生物快速準確檢測的現實需要，且在MYP平板上蠟樣芽孢桿菌容易擴散影響計數，因此，迫切需要建立新的快速檢測技術和方法。

近年來，聚合酶鏈反應(PCR)、免疫學等方法的應用，使蠟樣芽孢桿菌的快速檢測有了很大發展。但是這些技術也存在一定缺陷，比如技術要求較高，需要專業的技術人員進行操作，檢測費用昂貴等。PCR方法需要先進行細菌富集，不能區分活菌和死菌，容易產生假陽性；免疫學方法還需要制備高純度的抗體，因此這些技術很難滿足企業和政府監管部門對大批食品樣本檢測需要。

發明內容

本發明的目的是針對以上不足，從生物化學的角度出發，提出一種利用蠟樣芽孢桿菌特異性酶對其進行快速檢測的試劑盒及檢測方法。

本發明在分析蠟樣芽孢桿菌特異性生化反應的基礎上，篩選出細菌特異性酶，然后通過在分離培養基上加入細菌特異性酶的顯色底物，研制出顯色培養基，直接根據菌落顏色就可對菌株作出鑒定，同時結合高效的樣本前處理技術，由此開發出蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測試劑盒及檢測方法，用于蠟樣芽孢桿菌的快速診斷和監控，可大大節省檢測成本和時間，具有更廣泛的應用前景。

本發明的目的通過如下技術方案來實現：

所提出的蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測試劑盒，包括有：

(1)顯色培養基基礎成分，其配方為：蛋白胨8-12g，胰蛋白胨4-6g，酵母粉7-9g，磷酸鹽2.5-3.5g，丙酮酸鈉9～11g，氯化鎂0.8-1.2g，顯色底物X-GLU?0.35～0.55g，瓊脂11～13g，Na₂CO₃1～2g，pH7.0±0.2；

(2)培養基增補劑：Tween80；

(3)抗生素溶液：經過膜過濾除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml，內含100,000IU的硫酸多粘菌素B；

(4)樣品稀釋液：0.85％滅菌生理鹽水。

使用上述的試劑盒進行蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測的方法如下：

(1)配制顯色培養基：