[發明專利]一種用于檢測肝纖維化的液相芯片及其制備方法

有效

• 申請號: 200710031660.6
• 申請日: 2007-11-26
• 公開（公告）號: CN101178403A
• 公開（公告）日: 2008-05-14
• 發明（設計）人: 許嘉森;楊惠夷;林一群
• 申請（專利權）人: 廣州益善生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/546
• 分類號: G01N33/546
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司
• 代理人: 曾旻輝

1.一種用于肝纖維化檢測液相芯片，其特征是，主要包括有：

4-plex包被微球：III型前膠原的捕獲抗體包被的微球，IV型膠原及其片段的捕獲抗體包被的微球，層粘連蛋白的捕獲抗體包被的微球，和透明質酸酶的捕獲抗體包被的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；

4-plex生物素標記檢測抗體：分別用生物素標記的III型前膠原的檢測抗體，IV型膠原及其片段的檢測抗體，層粘連蛋白的檢測抗體，和透明質酸酶的檢測抗體；以及

鏈親和素藻紅蛋白。

2.一種制備如權利要求1所述的用于肝纖維化檢測的液相芯片的方法，其特征是，主要包括以下步驟：

(1)相應的捕獲抗體包被微球：

-將50μL微球活化后，≥8000g，離心；

-吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280μL?50mM的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s，再將微球于≥8000g，離心1-2min；重復該步驟；

-吸棄上清，將微球重懸于100μL?50mM?pH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；

-往懸浮的微球中加入相應的0.8-1.2μg抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550μL；

-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr；

-偶聯了抗體后的微球以≥8000g的速度，離心1-2min；

-吸棄上清，將微球重懸于500μL?PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲振蕩約20s；

-室溫避光振蕩30min；再于≥8000g，離心1-2min；

-吸棄上清，將微球重懸于1mL?PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；微球≥8000g，離心1-2min；重復該步驟一次；

-吸棄上清，將微球重懸于500-1000μL?PBS-TBN溶液中；

-每種包被好的微球通過luminex儀器計數后置于2-8℃避光單獨保存，使用時，依據檢測需要等比例混合；

(2)每種檢測抗體的生物素標記：

-依據檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至1mg/ml的體積，視為目標體積；

-配置10mg/ml的NHS-Biotin反應液；

-按摩爾比1∶100于反應管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應液；

-加入體積為目標體積的pH8.9的1/10的NaHCO₃溶液；

-加入pH7.4的PBS補至目標體積；

-包上鋁箔，將反應管置于振蕩器上，于25℃恒溫箱中避光孵育3-5小時，轉速為800rpm-1000rpm；

-將反應液轉至透析盒內，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應的NHS-Biotin；

-使用時根據需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是：所述活化微球的步驟如下：

-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球；

-取50μL微球離心1-2min；

-去掉上清夜，將微球重懸于100μL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，≥8000g離心1-2min；

-吸棄上清，加入pH6.2的80μL的磷酸鹽緩沖液，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s；

-加入10μL?50mg/mL?Sulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；

-加入10μL?50mg/mL?EDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；

-室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻。