[發明專利]唐魚β－actin基因遠端調控序列及其應用

無效

• 申請號: 200710031441.8
• 申請日: 2007-11-16
• 公開（公告）號: CN101260400A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發明（設計）人: 葉星;王海英;郁二蒙;白俊杰;簡清;夏仕玲;勞海華
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/65;C12N15/85
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體地說，涉及唐魚β-actin基因遠端調控序列、重組表達載體及應用。

背景技術

轉基因魚的研究作為轉基因動物研究領域的一部分，它的誕生是動物基因工程研究最突出的方面，也是目前國內外獲得最成功的轉基因動物之一。

與哺乳類相比，轉基因魚有其自身的優點，如魚類產卵量大、胚胎經基因轉移操作后不需放回母體內培育，攜帶的與人類卡相關的病原體較少等，所以通過轉基因魚進行基因表達調控、發育生物學、遺傳學、生理學等基礎研究具有潛在的經濟價值。

因為遠源基因存在著在受體魚細胞中的表達調控與生物學效應以及轉基因魚消費安全等問題，使用同源或親緣關系較近的魚類功能基因和調控序列不但具有安全性而且有助于魚類轉基因的有效表達，提高轉移基因的表達水平，所以從魚類基因組DNA中提取功能基因和調控序列在生物工程中有著重要的經濟利用價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有強啟動活性的唐魚β-actin基因遠端調控序列，以提高外源基因在轉基因魚類中的表達水平。

本發明的另一個目的是提供一種含有上述唐魚β-actin基因遠端調控序列的重組表達載體。

本發明的另一個目的是提供一種含有上述唐魚β-actin基因遠端調控序列的重組微生物。

本發明的進一步目的是提供上述唐魚β-actin基因遠端調控序列在轉基因魚類表達調控中的應用。

本發明將唐魚基因組DNA經內切酶EcoRV消化純化后與試劑盒GenomeWalker?Universal?Kit提供的接頭連接，RT-PCR擴增得到1800bp的特異帶，克隆測序為β-actin?5’側翼序列；根據此序列及已獲得的唐魚β-actin近端調控序列設計一對引物，以唐魚基因組DNA為模板，RT-PCR擴增出一條3000bp的特異帶，切膠回收后與載體pMD19-T連接轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α，測序確定為β-actin遠端調控序列，命名為TLA，包含1.8kb的5’側翼序列以及長為1.2kb的β-actin的第一個不翻譯的外顯子和第一個內含子。重組子命名為TLA-T。

本發明將唐魚β-actin基因遠端調控序列經粘端連接插入紅色熒光表達載體pDsRed2-1中，得到重組表達載體，命名為pTLA-DsRed(7.1kb)。

本發明克隆獲得的唐魚β-actin基因遠端調控序列具有強的啟動活性，其參與構建的重組表達載體經顯微注射到唐魚體內后外源基因可在唐魚體內高表達。將線性化后的重組熒光表達載體通過顯微注射入唐魚的受精卵中并孵化培育，熒光顯微鏡下觀察熒光，轉基因唐魚仔魚(孵化出膜72h)的體表可見紅色熒光，部分轉pTLA-DsRed仔魚則在解剖鏡下就可觀察到魚體背部呈現紅色熒光，而轉基因唐魚成魚在肉眼下則可觀察到紅色熒光；以已獲得的轉pTLA-DsRed基因唐魚和野生型唐魚的cDNA第一鏈為模板，對RFP和β-actin基因進行擴增及電泳。AlphaImager^TM圖像分析系統的相對半定量分析顯示：轉基因唐魚能檢測出外源基因RFP的mRNA，且mRNA有較高的表達量，其RFP?mRNA的表達量比由唐魚β-actin近端調控序列啟動的轉pTA-DsRed基因唐魚高35.7％。這與用熒光顯微鏡觀察RFP的表達的結果相同，說明3.0kb的唐魚β-actin基因遠端調控序列具有強的啟動活性。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：1、β-actin是管家基因，也是最主要的非肌肉型或胞質肌動蛋白異型體，從唐魚基因組DNA中得到β-actin基因遠端調控序列，包含有CCAAT框，TATA框、CArG框的上游調控序列以及下游的第一個外顯子和第一個內含子，該序列具有有效的驅動基因表達的功能，為下一步進行功能基因的轉移打下了基礎；2、由該遠端調控序列與紅色熒光表達載體構建的重組熒光表達載體，轉入魚卵后對成魚進行檢測證實，該重組熒光表達載體能使外源基因在魚類體內高效表達；3、本實驗得到的轉熒光基因唐魚體色紅艷，其體色不需要熒光燈的照射白天在室內也同樣艷麗，具有較高的觀賞性，有很高的經濟價值。

附圖說明

圖1為轉基因重組表達載體的詳細構建過程；

圖2為遠端調控序列TLA驅動的RFP基因在唐魚中的表達；

圖3為RFP在轉基因唐魚中表達的半定量分析；

圖4為轉基因唐魚中RFP與β-actin?mRNA表達量比值。

具體實施方式