[發明專利]EB病毒特異性TCR基因相關的重組質粒及構建抗EBV特異性CTL的方法

有效

• 申請號: 200710031341.5
• 申請日: 2007-11-09
• 公開（公告）號: CN101182531A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 李揚秋;吳秀麗;朱康兒;楊力建;陳少華
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/12
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種EB病毒特異性TCR基因相關的重組質粒，其特征在于：所述重組質粒是由TCRVα15基因、pIRES載體和TCRVβ1基因組成，即TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重組質粒，所述TCRVα15基因序列如下：

ATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCCTGTTTTTGTGGCTGCAGCTGGACTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGAGCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTCCGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAACTGCACTTACACAGACAGCTCCTCCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGAACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTGCTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACATGAAACAAGACCAAAGACTCACTGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACATCTGTCTCTGCGCATTGCAGACACCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGAacctATACAGCACCCTCACCTTTGGGAAGGGGACTATGCTTCTAGTCTCTCCAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCTGTGCAAACGCCTTCACACAGCATTATTCCAAAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGTTGTGGTCCAGC；

所述TCRVβ1基因序列如下：

ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAGCGGGAGGGgACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATATCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC。

2.利用權利要求1所述的TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重組質粒構建抗EB病毒特異性細胞毒T細胞的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)構建EBV特異性CTL克隆相關的TCRVα-pIRES-TCRVβ重組質粒：

(a)根據克隆性增殖的TCRVα15和TCRVβ1亞家族基因序列設計引物進行PCR反應，擴增TCRVα15基因序列的上游引物上帶有Xho?I酶切位點、下游引物上帶有EcoR?I酶切位點，所用上游引物為：CGCTCGAGAAGCAGTGGTATTAACGCAGAGTC；所用下游引物為：TCGAATTCTCAGCTGGACCACAACCCGCAGCG，擴增TCRVβ1基因序列的上游引物上帶有Xba?I酶切位點、下游引物上帶有Sa1?I酶切位點，上游引物為：CGTCTAGAAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA；下游引物為：CGGTCGACCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTCTT；分別獲得全長的TCRVα15和TCRVβ1亞家族基因PCR產物；

(b)將真核表達載體pIRES與純化后的TCRVα15?PCR產物分別用Xho?I和EcoR?I酶切，37℃水浴3h；雙酶切后的pIRES載體和TCRVα15?PCR產物進行連接反應：然后進行轉化；挑選陽性菌落，擴增培養后抽提質粒DNA，用Xho?I和EcoR?I雙酶切鑒定，同時在pIRES載體的IRES區設計一下游引物IRES-R即5’-TATAGACAAACGCACACCGG-3’，結合pIRES載體上游的T7公共引物即5’-TACGACTCACTATAGGCTAG-3’進行PCR鑒定，并對其進行雙向測序鑒定，證實序列正確后擴增陽性克隆并提取質粒，獲得EB病毒特異性細胞毒T細胞相關的TCRVα15-pIRES重組質粒；

(c)將TCRVα15-pIRES質粒與純化后TCRVβ1?PCR產物分別用Xba?I和Sa1?I酶切，37℃水浴3h；雙酶切后的TCRVα15-pIRES質粒和TCRVβ1?PCR產物進行連接反應：再將連接產物轉入感受態大腸桿菌DH5α；挑選陽性菌落，擴增培養后抽提質粒DNA，分別用Xba?I和Sa1?I以及Xho?I和EcoR?I兩組雙酶切鑒定；同時IRES區設計一上游引物IRES-F即5’-TAAAAAAACGTCTAGGCCCC-3’，結合pIRES載體下游的T3公共引物即5’-TAACCCTCACTAAAGGGAAG-3’進行PCR鑒定，再對其進行分段雙向測序鑒定，證實質粒中所含TCRVα15和TCRVβ1序列均正確無誤后，大量提取質粒，獲得EB病毒特異性細胞毒T細胞相關的TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重組質粒；

(2)EBV特異性CTL克隆相關的TCRVα-pIRES-TCRVβ重組質粒轉染T細胞，獲得特異性識別EBV相關抗原的高效CTL：利用脂質體轉染或電轉染或核轉染技術將EBV特異性TCR基因相關的TCRVα15-pIRES-TCRVβ1質粒轉入T細胞中，培養擴增后獲得抗EBV特異性CTL。