[發明專利]沙門氏菌恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及方法

無效

• 申請號: 200710030947.7
• 申請日: 2007-10-19
• 公開（公告）號: CN101246126A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 頓博影;李琳;石磊;王麗;耿予歡
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;C12Q1/68;C12Q1/24
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 何淑珍

1、一種沙門氏菌恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于，其試劑包括：

——引物混合液：四條引物濃度均為10pmol/μl，引物序列如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?IDNO.3、SEQ?ID?NO.4；

——Bst?DNA聚合酶：濃度為8U/μl；

——反應液：10mMdNTP∶10×ThermoPol反應緩沖液∶150mMMgSO₄＝8∶5∶2；

——樣品預處理液：20mMTris-HCl(pH8.0)，2mMEDTA，1.2％TritonX-100；

——顯色劑：熒光染料1×SYBR?Green?I；

——陽性對照為豬霍亂沙門氏菌基因組DNA，陰性對照為不含模板的反應混合液。

2、一種用權利要求1所述的試劑盒檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)待檢沙門氏菌基因組DNA提取過程：取過夜培養的增菌液于離心管中，1000rpm離心2分鐘，去上清；加入樣品預處理液于離心管中，與沉淀所得菌體混合均勻；沸水中煮10分鐘后立即置于冰上冷卻10分鐘；10000-12000rpm離心2分鐘，上清即可作為待檢沙門氏菌基因組DNA；其中增菌液與樣品預處理液的用量比為5∶8；

(2)恒溫基因擴增反應：在200ulPCR管配制反應混合液：引物混合物1.5μl，反應液5.5μl，Bst?DNA聚合酶0.5μl，(1)中得到的待檢沙門氏菌基因組DNA?2μl，加水至11.5μl；設置陽性對照反應時，用豬霍亂沙門氏菌標準菌株基因組DNA替代待檢沙門氏菌基因組DNA，設置陰性對照反應時，用不含模板的反應混合液替代待檢沙門氏菌基因組DNA；將含有配制好的反應混合液的PCR管于65℃反應1.5小時；

(3)分析判斷反應產物結果：在(2)中得到產物中加入2.5μl顯色劑，混勻，靜置5min；若顯現綠色則為陽性，橙色則為陰性。