[發明專利]一種檢測抗體親和力的方法

無效

• 申請號: 200710030562.0
• 申請日: 2007-09-27
• 公開（公告）號: CN101173923A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 彭臻菲;楊惠夷;許嘉森
• 申請（專利權）人: 廣州益善生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司
• 代理人: 曾旻輝

技術領域

本發明屬于醫藥生物類，具體地是涉及一種檢測抗體親和力的方法。

技術背景

抗體親和力是確定抗體性質的重要參數之一，同時，也是雜交瘤所分泌的單克隆抗體(McAb)穩定性的重要指標。它表示抗體與抗原結合的緊密程度。高親和力的抗體對于定量檢測及導向診治是有用的，而低親和力的抗體用于免疫純化較好。因此，要根據應用的目的選擇具有一定親和力的抗體，就需要先對抗體親和力進行檢測。

抗體親和力是指抗體和抗原結合的牢固程度，常用親和常數Ka表示。Ka是正/逆向反應速率常數的比值，單位為稀釋度單位(L/mol)，表示需將1mol抗體稀釋至多少升，才能使抗原-抗體結合下降50％；而Ka的倒數為解離常數(Kd)，其單位為濃度單位(mol/L)。為了提高免疫分析的靈敏度、精密度和準確度，選用Ka值高的抗體或抗血清是非常關鍵的。

目前對于抗體親和力的檢測一般采用平衡透析法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或放射免疫分析(RIA)的競爭結合試驗等。平衡透析法的全部抗原抗體反應過程在均一液相體系中完成，反應的動力學過程受到的干擾因素較少，基本上完全符合質量作用定律的前提條件要求。但該法僅能測定小分子抗原與相應抗體間的親和常數，同時要求將反應底物進行放射性標記，反應完成后又需將抗原抗體復合物與游離抗原抗體分開，實驗過程繁瑣、復雜，不易廣泛開展。RIA雖然靈敏度高，但會造成放射性污染和危害，且存在常用放射性核素半衰期短、無法自動化分析等諸多不足。理論上采用非競爭性ELISA法測定抗體親和常數還不十分完善。ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。同時，抗原的包被需4℃過夜，并且有多步的洗滌步驟，所需時間比較長。

液相芯片系統是生物芯片領域已經發展成熟的一項技術。

液相芯片系統包括Luminex儀器和不同熒光編碼的微球等。Luminex儀器是一自動化程度極高的檢測和分析儀器。熒光編碼的微球目前共有100種，可檢測100種與之相偶聯的不同種類的目標分子。將這些微球懸浮于一個液相體系中，就可以對同一個樣品中的多個不同的檢測對象同時進行檢測，這種檢測技術稱為xMAP(flexible?Multi-Analyte?Profiling)技術。

在微球的制造過程中，摻入了兩種不同的紅色熒光染料，根據這兩種染料的比例不同，可以把微球分為100種。在液相芯片系統中，為了區分不同的探針，每一種用于標記探針的微球都帶有一個獨特的熒光編碼。不同的微球共價結合了針對不同待檢測物的蛋白(抗體或抗原，用于免疫檢測)作為探針分子，檢測抗體中以生物素標記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、檢測抗體、熒光標記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統的讀取。Luminex閱讀系統分別激發紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強度，并根據微球中不同色彩而編號分類，從而確定反應物的類型；而綠色激光則檢測樣本中熒光標記物的熒光強度，再通過機器與計算機自動統計分析激光所檢測到微球種類、數量，從而判定待測樣本多種目標測試物的濃度。

液相芯片平臺的優勢：

(1)高通量，多指標并行檢測：液相芯片可對同一樣本中不同分子同時進行分析，在35-60分鐘內可對多達100種不同指標進行檢測；與傳統方法的逐個檢測相比，這是一個質的飛躍。

(2)敏感度高，重復性好：傳統的酶聯免疫吸附(ELISA)技術和平面芯片技術是對分子集合的光信號進行檢測得到結果，且只實現到半定量檢測；而液相芯片技術則可實現定量檢測，對單個微球熒光信號進行檢測，計算100個微球熒光值，取其中值(Median)，所以精確度高，重復性好。早期使用液相蛋白芯片的雙抗體夾心法來進行細胞因子的研究已經證明此類技術的靈敏度及檢測范圍比ELISA高出許多。

(3)操作簡單，節約時間，樣品與成本：液相芯片反應在懸浮的液相中進行，液相環境可以更好地保持蛋白的天然構象和活性，也更有利于探針和被檢測物的反應，所以反應時間短。反應后通常不用清洗即可以直接檢測，克服了平面固相芯片探針點樣式容易發生點樣錯位、耗時、平行等量加樣困難、加樣頭反復加樣易發生樣本間污染、重復性差等缺點，檢測效率大大高于平面固相芯片。

發明內容

本發明需要解決的技術問題是提供一種穩定可靠，操作簡單的同時檢測多種抗體親和力的方法。