[發明專利]志賀氏菌檢測用引物、檢測方法、檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200710030435.0
• 申請日: 2007-09-21
• 公開（公告）號: CN101153326A
• 公開（公告）日: 2008-04-02
• 發明（設計）人: 魏泉德;張彩虹;譚愛軍;張麗榮
• 申請（專利權）人: 珠海市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 楊煥軍

1.一種志賀氏菌檢測用引物，其特征在于，能擴增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因為志賀氏菌的ipaH---GenBank登陸號：M32063，所述引物與所述靶基因的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。

2.一種志賀氏菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成：

正向外引物F3-ipa????ATACCGTCTCTGCACGCA

反向外引物B3-ipa????TCGAAAAGGCCTTCTGATGC

正向內引物FIP-ipa?GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT

反向內引物BIP-ipa?TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT

可以擴增志賀氏菌的ipaH基因序列的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈。

3.根據權利要求2所述的志賀氏菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組還包括：

正向環引物LF-ipa?GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT

反向環引物LB-ipa?CGCTCACATGGAACAATCTCCGG。

4.根據權利要求3所述的志賀氏菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組可以擴增志賀氏菌的如下片斷或互補鏈：

所述正向外引物F3：擴增始于1095-1112bp；

所述正向內引物FIP：擴增始于1173-1194bp的互補序列和1124-1141bp；

所述反向外引物B3：擴增始于1280-1299bp的互補序列；

所述反向內引物BIP：擴增始于1207-1227bp，和1261-1279bp的互補序列；

所述正向環引物LF-ipa：擴增始于1144-1165bp的互補序列；

所述反向環引物LB-ipa：擴增始于1236-1258bp序列。

5.一種志賀氏菌的檢測方法，該方法用于檢測標本中是否存在志賀氏菌，其特征在于，以志賀氏菌的ipaH基因序列的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈為靶，通過LAMP法用上述引物或引物組選擇性擴增上述靶區域，確認是否存在有擴增產物。

6.根據權利要求5所述的志賀氏菌檢測方法，其特征在于，具體檢測方法為：

1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品、糞便、嘔吐物等標本；細菌待檢標本用相應腸道增菌液增菌培養8-12小時后，取1.0ml增菌液10000rpm離心2分鐘，棄其上清液后，用DNA提取試劑盒提取模板DNA或加20～30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul上清液做待檢模板DNA；

2)志賀氏菌的環介導等溫擴增

取擴增反應液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul～100ul的反應體系，混勻點離后在約65℃條件下恒溫保溫約40--90分鐘，然后置于80℃的環境下2分鐘滅活酶。