[發(fā)明專利]華南沿海七種巨蠣屬牡蠣的PCR－RFLP鑒別方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710030295.7
• 申請日: 2007-09-18
• 公開（公告）號(hào): CN101130815A
• 公開（公告）日: 2008-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喻子牛;夏建軍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 廣州科粵專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 賴漢光

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型的分子生物學(xué)方法，進(jìn)一步涉及一種華南沿海七種巨蠣屬牡蠣的PCR-RFLP鑒別方法。

技術(shù)背景

牡蠣是國內(nèi)外最主要的經(jīng)濟(jì)貝類之一，其肉味鮮美，素有“海中牛奶”之稱，極具營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。牡蠣養(yǎng)殖是貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中產(chǎn)量最大、分布最廣的產(chǎn)業(yè)，牡蠣養(yǎng)殖的總產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量都在所有養(yǎng)殖品種中位居首位。在我國養(yǎng)殖的就有6-7種之多，華南沿海的巨蠣屬牡蠣主要有太平洋牡蠣(C.gigas)、葡萄牙牡蠣(C.angulata)、香港巨牡蠣(C.hongkongensis)、有明巨牡蠣(C.ariakensis)、熊本牡蠣(C.sikamea)、C.iredalei和C.iredalei?sp。然而，由于牡蠣的貝殼形態(tài)可塑性很強(qiáng)，極易受到所處的環(huán)境影響，單純依靠貝殼的外部形態(tài)有時(shí)很難區(qū)分具體的種類，尤其對牡蠣幼體和稚貝更是如此；這對我國牡蠣資源的調(diào)查、研究和利用非常不利，同時(shí)，這也是一直困擾貝類分類學(xué)者的一個(gè)問題。分子生物學(xué)技術(shù)給這一問題提供了很好的解決辦法，線粒體16S?rDNA和COI序列在生物物種中非常保守，被廣泛應(yīng)用于物種的分類和進(jìn)化研究。利用其在各個(gè)物種之間存在的序列核甘酸的不同，使用限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增的16S?rDNA和COI序列酶切，可產(chǎn)生不同長度和數(shù)量的核甘酸片段，進(jìn)行普通的瓊脂糖凝集電泳即可分辨出不同種類。此方法在我國牡蠣種類的鑒定中還未見有公開報(bào)道，這將為華南沿海分布的巨蠣屬種類的鑒定提供科學(xué)的方法，對牡蠣選擇育種和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種對華南沿海七種巨蠣屬牡蠣的PCR-RFLP鑒別方法。它適用范圍廣，操作簡單，對儀器設(shè)備要求低，檢測快速，更準(zhǔn)確，相比形態(tài)學(xué)方法可靠性高。

本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：首先利用大量測序的華南地區(qū)牡蠣種類的16S?rDNA和COI序列，通過DNAstar中的MapDraw軟件分析，選取適合的內(nèi)切酶組合；隨后，進(jìn)行基因組DNA提取和目的片段的PCR擴(kuò)增；最后利用選取的內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物酶切和瓊脂糖凝膠電泳檢測，具體步驟如下：

(1)選取內(nèi)切酶組合

對華南沿海巨牡蠣屬種類，根據(jù)其已獲得的16S?rDNA和COI序列，通過ClustalW進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)和檢測不同種類間序列的差異，應(yīng)用MapDraw軟件分析，選出內(nèi)切酶組合，其中對16S?rDNA片段挑選出Dde?I/Dra?I和Alu?I/Mse?I兩組雙酶切組合，對COI序列片段挑選出Nis?I/Alu?I和Nis?I/Dde?I兩組雙酶切組合；

(2)基因組DNA提取

A.取閉殼肌組織0.1克，加入700ul抽提緩沖液中在37℃下消化過夜；

B.用等體積比例體積比25∶24∶1的酚-氯仿-異戊醇混合液，充分振蕩混勻，12000g/分，離心10-15分鐘；

C.取上清液，重復(fù)步驟B；

D.加入等體積的氯仿，混勻，12000g/分，離心5-10分鐘；

E.取上清液，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積3M的乙酸鈉；

F.12000g/分，離心12-20分鐘，去上清液，70％乙醇洗滌1-2次；

G.讓乙醇徹底揮發(fā)，將基因組DNA沉淀溶于50ul無菌純凈水，即得基因組DNA，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)目的片段PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為50ul，包含5ul?10×buffer，0.6ul?2.5U/ul?Taq酶，100ng基因組DNA，引物為0.2uM，dNTP為0.2mM，Mg²⁺為2mM；PCR反應(yīng)條件為，先預(yù)變性94℃2分鐘，而后進(jìn)行94℃變性45秒，對COI?48℃或?qū)?6S?50℃復(fù)性1分鐘和72℃1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘，得擴(kuò)增樣品；擴(kuò)增16S和COI基因片段兩對通用的引物分別為：

16SarL/16SarH：5`-CGGTGTTTATCAAAAACAT-3`/5`-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3`；

COIL1/COIH：5`-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3`/5`-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAA?TCA-3`；

(4)酶切反應(yīng)