[發明專利]鏈親和素－腫瘤壞死因子α融合蛋白

無效

• 申請號: 200710030120.6
• 申請日: 2007-09-06
• 公開（公告）號: CN101148478A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發明（設計）人: 高基民;林來新妹;周明乾;胡志明
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N1/21;A61K38/16;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所
• 代理人: 胡濟元

技術領域

本發明涉及基因工程和蛋白質工程領域，具體涉及腫瘤壞死因子α的重組蛋白。

背景技術

腫瘤壞死因子α(TNFα)由細菌脂多糖等活化的單核-巨噬細胞產生，可引起腫瘤組織出血壞死，具有如下功能：能直接殺滅腫瘤細胞而不損傷正常細胞；能增強巨噬細胞的活性和殺傷功能，增強巨噬細胞促進免疫應答的能力，發揮抗感染作用；能促進炎癥局部的中性粒細胞的活性和聚集；能促進T淋巴細胞產生干擾素、IL-6等，增強機體抗病能力；能與IL-1、IL-2、干擾素等協同增強免疫力。但是，腫瘤壞死因子α血中濃度過高時，可引起休克、高熱及肺、心臟和腎上腺損害，從而大大地限制了它的臨床應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種可以對腫瘤細胞進行快速表面修飾并能夠永久地錨定在腫瘤細胞表面的新型腫瘤壞死因子α。

本發明解決上述技術問題的技術方案是：

一種融合蛋白，該蛋白主要由鏈親和素、接頭肽和腫瘤壞死因子α連接構成，其中鏈親和素連接在接頭肽的N端，腫瘤壞死因子α連接在接頭肽的C端；所述的接頭肽為Ser?Ser?GlyGly?Ser?Gly?Gly?Gly?Gly?Ser?Gly?Gly?Gly?Gly?Ser。

本發明融合蛋白可通過將鏈親和素基因、腫瘤壞死因子α基因以及連接所述的鏈親和素和腫瘤壞死因子α的接頭多核苷酸通過基因重組、轉化構建工程菌表達獲得，其中基因重組和轉化的方法均為本領域普通技術人員所熟識的技術。

為了便于融合蛋白的分離純化，本發明所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還可以連接有純化標簽，如組氨酸標簽等。

本發明所述的融合蛋白，其氨基酸序列可以是SEQ?NO.1或SEQ?NO.2。

本發明還提供一種編碼本發明融合蛋白的融合基因，該融合基因由成熟鏈親和素cDNA、腫瘤壞死因子αcDNA通過TCG?AGC?GGG?GGC?AGC?GGG?GGC?GGA?GGC?AGC?GGC?GGGGGC?GGA?TCC連接而成；該多核苷酸的成熟鏈親和素cDNA的末端還可以連接有CAT?CATCAC?CATCAC?CAT。

將所述的編碼本發明融合蛋白的融合基因通過基因重組插入到原核表達載體中，然后轉化大腸桿菌可獲得能表達本發明融合蛋白的工程菌。

本發明還提供一種高效表達本發明融合蛋白的工程菌，該工程菌是轉化了本發明融合基因的pET24重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)，其制備方法是：將本發明融合基因克隆于帶有T7啟動子的表達載體pET24中，構建成含有本發明融合基因的表達質粒，??轉化大腸桿菌BL21(DE3)后實現了高效表達，本發明融合蛋白在菌體中以包涵體的形式存在，表達量高達30～40％；從包涵體中分離純化蛋白并復性處理后，即可獲得本發明融合蛋白。

本發明融合蛋白同時具有鏈親和素和腫瘤壞死因子α的活性，可通過鏈親和素與生物素的強力結合將腫瘤壞死因子α錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，且能在γ射線滅活腫瘤細胞表面穩定存在，并仍保持腫瘤壞死因子α的活性；但如果將本發明融合蛋白中的鏈親和素連接在接頭肽的C端，則所得的融合蛋白沒有腫瘤壞死因子α的活性。

經本發明融合蛋白表面修飾的腫瘤疫苗具有預防和治療腫瘤的作用，可用于制備預防和治療腫瘤的疫苗。本發明所述的腫瘤疫苗是將本發明融合蛋白錨定在生物素化的腫瘤細胞表面獲得的。

本發明所述的腫瘤疫苗的制備充分利用了蛋白質的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物素與鏈親和素高效而強有力幾乎不可逆的結合這兩個特性，先用生物素化試劑將生物素化學交聯到欲修飾的腫瘤細胞表面，然后本發明融合蛋白借助鏈親和素與生物素的特異結合將腫瘤壞死因子α迅速永久地錨定在腫瘤細胞表面，從而使腫瘤壞死因子α在局部達到持續有效的治療濃度，以至不會引起全身的毒副反應。此外，由于一個鏈親和素蛋白可結合四個生物素，因此本發明融合蛋白錨定到腫瘤細胞的量是可以精確控制的。

附圖說明

圖1是6His-SA-L-TNFα-pET24重組質粒的結構圖。

圖2是6His-SA-L-TNFα的SDS-PAGE電泳圖，其中1是蛋白質分子量標準，2是未誘導全菌，3是誘導后全菌，4是包涵體，5和6是純化的融合蛋白。

圖3是用抗TNFα單克隆抗體及熒光標記的二抗經流式細胞儀對錨定在生物素化的B16.F10表面上本發明融合蛋白進行檢測的結果，左峰為未修飾的細胞(陰性對照)，而右峰為錨定修飾的細胞。