[發明專利]鏈親和素－白細胞介素2融合蛋白

無效

• 申請號: 200710030119.3
• 申請日: 2007-09-06
• 公開（公告）號: CN101148477A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發明（設計）人: 高基民;胡志明;周明乾;林來新妹
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K38/16;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所
• 代理人: 胡濟元

技術領域

本發明涉及基因工程和蛋白質工程領域，具體涉及來源于動物的多肽，特別是白細胞介素-2。

背景技術

白細胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一種T細胞生長因子和信號調節分子，有很重要的免疫調節作用。有如下功能：促進T細胞增殖，提高細胞毒T細胞、NK細胞和單核細胞活性；誘導B細胞生長和抗體產生；誘導周圍血中淋巴細胞衍生為LAK細胞；誘導繼發的細胞因子分泌，如TNFαt、GM-CSF、IFN等；增強T細胞表面的IL-2受體的表達。因此，IL-2具有抗病毒、抗腫瘤和增強機體免疫功能等作用。IL-2基因常用來修飾腫瘤細胞，制備腫瘤細胞疫苗，以增強腫瘤抗原的免疫原性。通過原位基因轉染(或轉導)在腫瘤病灶局部實現IL-2持續有效表達的治療策略，已在表淺膀胱癌的臨床前研究中顯示出誘人的前景。但是，用基因修飾法制備腫瘤細胞疫苗存在如下固有缺陷：修飾效率一般都較低(尤其是原位基因轉染或轉導)，并取決于腫瘤細胞類型；因影響因素較多，致使治療基因的蛋白質表達產物的有效濃度在局部難于達到并較長時間地維持，從而實際抗腫瘤的臨床效果非常有限；因個體差異和獲得腫瘤標本時腫瘤細胞的成活狀態不一致，往往有些病人因無法提供成活狀態較好的腫瘤細胞，最終不能制成自體腫瘤細胞疫苗；往往有潛在的病毒載體安全性問題(所謂“遺傳毒性”)和免疫原性問題(反復使用同一病毒載體會影響導入基因的表達效率)；很難同時高效表達多個具有協同作用的免疫刺激因子，并對它們的表達量進行精確控制。此外，基因修飾的自體腫瘤細胞疫苗制備比較費時，不易大規模開展和廣泛使用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種可以對腫瘤細胞進行快速表面修飾并能夠永久地錨定在腫瘤細胞表面的新型白細胞介素-2。

本發明解決上述技術問題的技術方案是：

一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細胞介素-2構成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser?Ser?Gly?Gly?Ser?Gly?Gly?Gly?Gly?Ser?Gly?Gly?Gly?Gly?Ser。

本發明融合蛋白中的鏈親和素位于接頭肽的N端或C端；其中鏈親和素位于接頭肽的N端的融合蛋白(如SEQ?NO.2)的活性比鏈親和素位于接頭肽的C端的融合蛋白(如SEQ?NO.1)高兩倍以上。

本發明融合蛋白可通過將鏈親和素基因、白細胞介素-2基因以及連接所述的鏈親和素和白細胞介素-2的接頭多核苷酸通過基因重組、轉化構建工程菌表達獲得，其中基因重組和轉化的方法均為本領域普通技術人員所熟識的技術。

為了便于融合蛋白的分離純化，本發明所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還可以連接有純化標簽，如本發明融合蛋白SEQ?NO.3的鏈親和素的C端連有組氨酸標簽、本發明融合蛋白SEQ?NO.4的鏈親和素的N端連有組氨酸標簽。

本發明還提供一種編碼本發明融合蛋白的多核苷酸，該多核苷酸由成熟鏈親和素cDNA、成熟白細胞介素-2?cDNA通過TCG?AGC?GGG?GGC?AGC?GGG?GGC?GGA?GGC?AGC?GGCGGG?GGC?GGATCC連接而成；該多核苷酸中成熟鏈親和素cDNA的末端還可以連接有CATCATCAC?CATCAC?CAT。

將所述的編碼本發明融合蛋白的多核苷酸通過基因重組插入到原核表達載體中，然后轉化大腸桿菌可獲得高效表達本發明融合蛋白的工程菌；所述的原核表達載體可以是pET24a或pET24d，大腸桿菌為BL21(DE3)。

本發明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵體的形式存在，從包涵體中分離純化蛋白并復性處理后，即可獲得本發明融合蛋白。

本發明融合蛋白采用富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽連接白細胞介素-2和鏈親和素，此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元蛋白質分子的獨立折疊，從而保存各自的生物活性，使融合蛋白具有鏈親和素和白細胞介素-2的雙重活性，可通過鏈親和素與生物素的強力結合將白細胞介素-2錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，且能在γ射線滅活腫瘤細胞表面穩定存在，并仍保持白細胞介素-2的活性。

經本發明融合蛋白表面修飾的腫瘤疫苗具有預防和治療腫瘤的作用，可用于制備預防性和治療性腫瘤的疫苗。本發明所述的腫瘤疫苗是將本發明融合蛋白錨定在生物素化的腫瘤細胞表面獲得的。