[發明專利]利用原生質體不對稱融合技術獲得香蕉體細胞雜種的方法

無效

• 申請號: 200710029667.4
• 申請日: 2007-08-10
• 公開（公告）號: CN101139582A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 肖望;黃學林;黃霞;魏岳榮;龔慶
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/05
• 分類號: C12N15/05;A01H4/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明屬于香蕉體細胞雜交技術領域，特別涉及一種利用原生質體不對稱融合技術獲得香蕉體細胞雜種的方法。

背景技術

目前，栽培的香蕉病害猖獗，面臨著包括真菌、細菌、病毒和生理性病害病以及線蟲等種類繁多的病害威脅，特別是香蕉枯萎病第4號生理小種(Fusarium?oxysporum?f.sp.Cybense?Snyder&Hansed，race?4)，已成為我國香蕉毀滅性的病害，加之寒害等非生物逆境的襲擊，香蕉生產面臨著嚴峻的考驗，急需培育出品質優良的具有抗病、抗逆性的香蕉新品種。由于栽培蕉高度不育、無種子，因此通過傳統雜交育種方法難于獲得新品種，而利用體細胞雜交技術是獲得高抗性香蕉新品種的育種途徑之一。建立適合于目標基因型的穩定高效的香蕉原生質體培養及其融合再生系體系是進行香蕉體細胞雜交育種的前提。

目前所報道的香蕉體細胞雜交技術常采用對稱電融合法或者對稱PEG融合法將香蕉原生質體直接進行融合，融合產物懸浮于原生質體液體培養基中進行看護培養，獲得的細胞團在體胚誘導培養基上進行體胚誘導并萌發，最后獲得完整的植株；再生植株再經過RAPD、流式細胞技術或其它形態學方法進行篩選、鑒定，最后獲得體細胞雜種。這些技術體系主要存在以下幾方面的不足：①用于融合產物培養的原生質體液體培養基組成復雜，成份多達37種，且含有不少價格昂貴、不常用的試劑，如維生素A(V_A)、維生素D3(V_D3)、玉米素等；②融合產物的各個培養階段所采用的培養基配方各不相同，使得原生質體融合工作繁瑣、耗時；③原生質體融合后，如何篩選、鑒定體細胞雜種工作量大。由于上述現有技術的不足，限制了通過體細胞雜交技術培育香蕉新品種的進一步應用。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足之處，本發明的目的在于提供一種利用原生質體不對稱融合技術獲得香蕉體細胞雜種的方法。

本發明的目的通過下述方案實現：一種利用原生質體不對稱融合技術獲得香蕉體細胞雜種的方法，包括如下步驟：

(1)香蕉原生質體的分離和純化：將繼代培養3～5d、直徑200μm以下的香蕉胚性懸浮細胞(ECS)與酶解液混合，細胞密實體積(packed?cellvolume，PCV)與酶解液體積比例為1∶3～5，在27±1℃、黑暗條件下，30～50rpm震蕩8～10h進行酶解；將酶解后的混合物分離純化得到香蕉受體原生質體或香蕉供體原生質體。

(2)香蕉受體原生質體的處理：將步驟(1)獲得的香蕉受體原生質體采用最低致死劑量的碘乙酰胺(IOA)處理14～18min，將處理后的混合液用原生質體洗滌液洗滌2～3次，最后用原生質體液體培養基將處理過的原生質體稀釋到濃度為10⁵～10⁶個/mL。

香蕉供體原生質體的處理：將步驟(1)獲得的香蕉供體原生質體用原生質體液體培養基稀釋到濃度為10⁵～10⁶個/mL，然后鋪成薄層，以保證原生質體的厚度為1～2層細胞，在紫外燈下照射60～180s。

(3)原生質體的不對稱融合：將步驟(2)處理后的受體原生質體和供體原生質體，按體積比1∶1混合得到原生質體懸液；將原生質體懸液采用聚乙二醇(PEG)融合法進行融合得到融合產物。

(4)融合產物的看護培養：將1.2％(w/v)、pH?5.6～5.8的瓊脂糖溶液滅菌后，溫度降到30～35℃時，等體積加入到含15～20mL?PCV％看護細胞的液體看護培養基中攪勻，凝固后，在其上覆蓋一層消毒過的混合纖維素濾膜，將步驟(3)的融合產物轉到混合纖維素濾膜上，在27±1℃、黑暗下培養，直到長出肉眼可見0.5～1.0mm的融合產物的細胞團；所述看護細胞為直徑小于200μm的香蕉胚性懸浮細胞(ECS)。

(5)從融合產物獲得細胞團的體胚誘導：將步驟(4)中獲得的融合產物的細胞團轉到體胚誘導培養基上，進行體胚誘導，得到直徑約為1.0～1.5mm的成熟體胚。

(6)體胚的萌發與成苗：將步驟(5)中誘導得到的成熟體胚轉移到體胚誘導培養基上，每隔15～20d繼代一次直到體胚萌發，得到再生苗，將芽高2～3cm的再生苗進行培養，即可得到體細胞雜種植株。

為了更好地實現本發明，所述酶解液組成為：1.52％(w/v)KCl+0.98％(w/v)CaCl₂+3.5％(w/v)纖維素酶R-10+1％(w/v)離析酶R-10+0.15％(w/v)果膠酶Y-23，pH?5.6～5.8。