[發明專利]家蠅抗菌肽基因及其篩選克隆方法

無效

• 申請號: 200710029081.8
• 申請日: 2007-07-09
• 公開（公告）號: CN101139593A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 朱家勇;劉雷山;金小寶
• 申請（專利權）人: 廣東藥學院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳衛

1.一種家蠅抗菌肽基因，其特征在于序列表如SEQ?ID?NO：1，全長460bp，從57bp～356bp、起始密碼子為ATG、終止密碼子為TAA、含300bp的區域編碼99個氨基酸。

2.權利要求1所述家蠅抗菌肽基因的篩選克隆方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)采用基因芯片技術篩選出家蠅相關基因；

(2)設計簡并引物，獲取同源片斷；

(3)行RT-PCR擴增出基因片段；

(4)以全長文庫做模板，結合文庫通用引物行特異性PCR擴增出該抗菌肽基因的全長序列。

3.根據權利要求2所述家蠅抗菌肽基因的篩選克隆方法，其特征在于步驟(1)包括以下步驟：

(1)設計探針，將探針點印在芯片上構建寡核苷酸探針微陣列，打印好的芯片經紫外交聯處理后放暗盒中保存備用；

(2)芯片預雜交處理；

(3)提取和純化家蠅脂肪體總RNA，逆轉錄成cDNA并標記上熒光標記物Cy3，與構建的寡核苷酸探針微陣列芯片雜交；

(4)經洗片、掃描處理后進行數據分析。

4.根據權利要求3所述家蠅抗菌肽基因的篩選克隆方法，其特征在于步驟(3)所述家蠅是經過誘導的家蠅三齡期幼蟲。

5.根據權利要求4所述家蠅抗菌肽基因的篩選克隆方法，其特征在于所述誘導是取家蠅三齡期幼蟲，用昆蟲針蘸取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合菌液，從腹部進行刺針，再放回飼養24小時后收集。

6.根據權利要求2所述家蠅抗菌肽基因的篩選克隆方法，其特征在于步驟(2)所述設計簡并引物為：

上游簡并引物A1：5′-GHGGHWSBCCHAARGATGG-3′19bp

下游簡并引物A2：5′-RTTDCCRTADGGDCCDCC-3′18bp。

7.根據權利要求2所述家蠅抗菌肽基因的基于基因芯片篩選克隆方法，其特征在于步驟(3)所述行RT-PCR擴增出基因片段包括目的基因cDNA的3′端克隆和目的基因cDNA?5′端克隆。

8.根據權利要求7所述家蠅抗菌肽基因的基于基因芯片篩選克隆方法，其特征在于所述目的基因cDNA的3′端克隆引物為

上游引物B1：5′CAA?TGT?AAA?TGC?CGA?TGT?C?3′(19bp)

下游引物p2：5/?TAA?TAC?GAC?TCA?CTA?TAG?GGC?3/(21bp)。

9.根據權利要求7所述家蠅抗菌肽基因的基于基因芯片篩選克隆方法，其特征在于所述目的基因cDNA?5′端克隆引物為

上游引物P1：5/??CTC?CGA?GAT?CTG?GAC?GAG?C?3/????(19bp)

下游引物B2：5′TTA?CAT?TGC?CTT?AAA?AAT?CAC?CT?3′(23bp)。