[發(fā)明專利]非融合骨唾液酸蛋白的酵母表達載體及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710027792.1
• 申請日: 2007-04-28
• 公開（公告）號: CN101063147A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王捷;夏冰
• 申請（專利權(quán)）人: 王捷;夏冰
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/12;C07K14/47;C07K16/18;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司
• 代理人: 李海波

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

骨唾液酸蛋白(Bone?sialoprotein，簡稱BSP)是細胞外基質(zhì)中的一種酸性糖蛋白，其組織分布具有局限性，分布在礦化組織，包括骨、牙齒和鈣化的軟骨等，主要由成骨細胞、破骨細胞以及軟骨細胞表達和分泌。骨唾液酸蛋白參與組織礦化，與多種骨代謝性疾病有關(guān)，近年來又發(fā)現(xiàn)BSP與腫瘤的骨轉(zhuǎn)移、動脈粥樣硬化及血管增生有關(guān)。為了深入研究BSP的生物活性，必須獲得穩(wěn)定的BSP?？蓮膭游锘蛉斯侵刑崛SP，但來源有限，且提純的方法繁瑣，因此，利用基因工程技術(shù)表達重組BSP對于研究BSP的結(jié)構(gòu)與功能有重要意義。

目前在原核表達系統(tǒng)中要表達全長BSP還存在問題，只能得到一些具有空間折疊的未修飾的BSP片段，功能也比天然BSP分子要弱。在真核細胞中已經(jīng)表達出全長BSP，但除了本申請人，應(yīng)用酵母表達系統(tǒng)來表達rBSP還未見報道。本申請人曾將人BSP基因克隆到畢赤酵母表達載體pPICZαA上，以融合蛋白的形式表達重組BSP。但是，融合蛋白上短肽尾巴的加入可能會改變蛋白的折疊形式，從而影響蛋白的生物活性和功能。其次，由于重組BSP糖基化程度較高，含有大約一半的碳水化合物，難于獲取結(jié)晶，不適于用X射線衍射和磁共振(NMR)分析其結(jié)構(gòu)。因此，亟需建立能獲得BSP非融合表達蛋白的基因工程方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種非融合骨唾液酸蛋白的表達載體，研究結(jié)果可為進一步研究BSP的結(jié)構(gòu)和功能以及放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明的另一目的在于提供非融合骨唾液酸蛋白的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種非融合骨唾液酸蛋白的酵母表達載體pPICZαA-2×hbsp，通過以下步驟獲得：

1)根據(jù)GenBank中人骨唾液酸蛋白基因(hbsp)序列設(shè)計基因特異性引物：

上游引物：5’-AGGAATTCGACTGCCAGAGGAAGCAATCAC-3’

下游引物：5’-CGGAATTCACTGGTGGTGGTAGTAATTCTG-3’

以骨唾液酸蛋白(BSP)基因為模板，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從人股骨外膜組織的總RNA中擴增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript?II?RI質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pB-hbsp；

2)根據(jù)畢赤酵母分泌型表達質(zhì)粒pPICZaA及hbsp序列設(shè)計PCR設(shè)計引物：

上游引物：5’-CCG?CTCGAG?AAA?AGA?TTC?TCA?ATG?AAA?AAT?TTG-3’

下游引物：5’-GG?GGTACC?TCA?CTG?GTG?GTG?GTA?GTA?ATT?CTG-3’

以重組質(zhì)粒pB-hbsp為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與畢赤酵母表達載體pPICZaA重組，構(gòu)建分泌型重組質(zhì)粒pPICZαA-hbsp，再利用表達載體序列上的一對同尾酶BamH?I和Bgl?II構(gòu)建含有BSP基因兩個串連的表達盒的質(zhì)粒pPICZαA-2×hbsp。

本發(fā)明提供的非融合骨唾液酸蛋白的制備方法是：將表達載體pPICZαA-2×hbsp線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，通過甲醇誘導(dǎo)表達，獲得重組人骨唾液酸蛋白。

本發(fā)明提供的非融合骨唾液酸蛋白可應(yīng)用在制備單克隆及多克隆抗體中，為深入研究BSP免疫學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)和探索其作為藥物治療靶點的可行性奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明的技術(shù)方案細述如下：

(1)構(gòu)建BSP的克隆質(zhì)粒pB-hbsp

根據(jù)GenBank中人骨唾液酸蛋白基因(hbsp)序列設(shè)計基因特異性引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從人股骨外膜組織的總RNA中擴增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript?II?RI質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pB-hbsp。

(2)骨唾液酸蛋白基因的亞克隆

應(yīng)用PCR技術(shù)從pB-hbsp重組質(zhì)粒獲得人BSP基因，上游引物：5’-CCGCTCGAG?AAA?AGA?TTC?TCA?ATG?AAA?AAT?TTG-3’，下游引物：5’-GGGGTACC?TCA?CTG?GTG?GTG?GTA?GTA?ATT?CTG-3’。將其克隆到畢赤酵母表達載體pPICZαA上，獲得含人BSP基因的重組質(zhì)粒pPICZαA-hbsp，并對目的基因進行測序。

(3)多拷貝非融合BSP畢赤酵母表達載體的構(gòu)建

利用表達載體序列上的一對同尾酶BamH?I和Bgl?II構(gòu)建含有BSP基因兩個串連表達盒的質(zhì)粒pPICZαA-2×hbsp。

(4)rhBSP畢赤酵母工程細胞的構(gòu)建