[發(fā)明專利]一種染色液及其染色方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710026446.1
• 申請日: 2007-01-19
• 公開（公告）號: CN101225428A
• 公開（公告）日: 2008-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 廖富蘋;王正勇;林健榮
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司
• 代理人: 郝傳鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞活力檢測領(lǐng)域，特別涉及一種用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液及使用該染色液鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法及該方法在鑒別家蠶微孢子蟲活力中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

養(yǎng)蠶業(yè)是我國的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，有著悠久的歷史，在滿足人民物質(zhì)生活需要的同時(shí)，也成為我國人民與睦鄰各國友好交往的紐帶，其中著名的絲綢之路便源自桑蠶生產(chǎn)。現(xiàn)今養(yǎng)蠶業(yè)在豐富人民物質(zhì)生活、增加農(nóng)民收益的同時(shí)，也為國家創(chuàng)造了大量的外匯和財(cái)富。然而，長期以來，養(yǎng)蠶業(yè)卻受家蠶微粒子病的困擾。家蠶微粒子病是由家蠶微孢子蟲(Nosema?bombycis)引起的一種危害嚴(yán)重的傳染病，也是蠶業(yè)生產(chǎn)唯一被檢疫的對象。在19世紀(jì)中葉，家蠶微粒子病曾導(dǎo)致法國和意大利等國的養(yǎng)蠶業(yè)幾乎全部毀滅。

我國政府大力推行科學(xué)養(yǎng)蠶技術(shù)，制訂了嚴(yán)格的蠶種生產(chǎn)監(jiān)管法規(guī)，然而由于蠶種生產(chǎn)的特殊性，蠶種場仍受到微粒子病的嚴(yán)重威脅，全國仍有約85％的蠶種場會發(fā)生該病，一旦發(fā)病率超過國家規(guī)定的監(jiān)管條例，所生產(chǎn)的蠶種便要遭燒毀、淘汰，有的蠶種場一年因此造成的損失數(shù)以百萬元計(jì)，輕則造成企業(yè)嚴(yán)重虧損，重則沒有蠶種供應(yīng)蠶農(nóng)，造成面上養(yǎng)蠶生產(chǎn)的更大損失。尤其是近年來野外昆蟲微粒子病與家蠶的交叉感染引起的損失日益嚴(yán)重，因此，對該病發(fā)病規(guī)律、防治方法和消毒藥物篩選的進(jìn)一步深入研究顯得非常重要。

孢子為感染期蟲體，它是微孢子蟲生活史中的一個(gè)發(fā)育階段。孢子個(gè)體微小，即使在顯微鏡下觀察，也難以從形態(tài)上區(qū)分其死活。蠶發(fā)病需要一定的活孢子數(shù)量，不同蠶品種、不同發(fā)育齡期、不同飼料質(zhì)量和飼育環(huán)境，都對致病所需活孢子數(shù)量有影響，所以實(shí)際上無法確知導(dǎo)致蠶死亡所需的活孢子數(shù)量或具體比例。

現(xiàn)有的一種鑒別孢子活力的方法是用生物試驗(yàn)：將經(jīng)處理的家蠶孢子添食2齡起蠶，桑葉喂養(yǎng)至一定時(shí)間后逐頭解剖顯微鏡檢查，最后統(tǒng)計(jì)患病率，以不發(fā)病區(qū)認(rèn)定為孢子死亡。此法需時(shí)長(約10～20天)、工作量大、所需設(shè)備多、且中間因素影響大。

現(xiàn)有技術(shù)中鑒別孢子活力的方法還有采用孢子發(fā)芽鑒別的方法，但由于孢子極絲細(xì)小(長約120～140μm，寬約0.1μm)，即使用相差顯微鏡觀察，其效果也欠佳，如要觀察出準(zhǔn)確的活孢子數(shù)目或孢子的活力程度則更難則更難。而通常鑒別細(xì)胞活力的染色方法，如苔盼藍(lán)染色法、美蘭染色法等，由于孢子外壁的特殊結(jié)構(gòu)，如皮膜很厚等原因，染色效果均不理想。

本發(fā)明就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足而提出的一種鑒別微孢子蟲的孢子活力的新方法。本發(fā)明所稱的孢子活力是指孢子的生存狀態(tài)，孢子有可能處于存活、死亡或正在死亡的狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述方法在鑒別家蠶微孢子蟲活力中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液包括如下組分：0.05％-0.3％吖啶橙溶液3份；0.0067％-0.026％碘化丙啶溶液1份，所述吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液是由0.38％NaCl溶液或雙蒸水配制而成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所述原蟲細(xì)胞為蠶微孢子蟲的孢子。

本發(fā)明提供的使用所述染色液鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法，包括如下步驟：

(1)取材：提供原蟲細(xì)胞，備用；

(2)配制染色液：將0.05％-0.3％吖啶橙溶液和0.0067％-0.026％碘化丙啶溶液按3∶1混合，過濾備用；

(3)染色：將原蟲細(xì)胞涂片陰干，用步驟(2)提供的染色液染色，雙蒸水緩慢沖洗，干燥；

(4)鏡檢：于490nm激發(fā)濾光片和510nm光柵濾光片熒光顯微鏡下觀察；

(5)鑒別：根據(jù)鏡檢結(jié)果的顏色變化鑒別原蟲細(xì)胞活力。

當(dāng)步驟(1)提供的原蟲細(xì)胞是冷藏的，需置室溫下恢復(fù)常溫才可備用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)中所述的吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液是由0.38％NaCl溶液配制而成。優(yōu)選地，步驟(3)中所述的染色時(shí)間為5-20分鐘，優(yōu)選10分鐘。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(1)提供的原蟲細(xì)胞為蠶微孢子蟲的孢子。

本發(fā)明提供的所述染色液在鑒別家蠶微孢子蟲活力中的應(yīng)用是根據(jù)所述方法獲得的鏡檢結(jié)果的顏色變化來鑒別蠶微孢子蟲的孢子的活力，以此來檢測家蠶是否帶有微粒子病。