[發明專利]一種交聯枯草桿菌蛋白酶晶體的制備方法

有效

• 申請號: 200710025782.4
• 申請日: 2007-08-02
• 公開（公告）號: CN101139579A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 袁方;李銳
• 申請（專利權）人: 張家港澳潔生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/56
• 分類號: C12N9/56
• 代理公司: 張家港市高松專利事務所
• 代理人: 黃春松

技術領域

本發明涉及到一種交聯枯草桿菌蛋白酶晶體的制備方法。

背景技術

酶(Enzyme)是活細胞內產生的具有高度專一性和催化效率的蛋白質，又稱為生物催化劑。生物體在新陳代謝過程中，幾乎所有的化學反應都是在酶的催化下進行的。人類對酶的認識源遠流長。我國4千多年前的夏禹時代就釀酒盛行，周朝已開始制醋、醬，并用曲來治療消化不良。酶的系統研究起始于19世紀中葉對發酵本質的研究。1858年，法國化學及生物學家路易斯巴斯德(Louis?Pasteur)用一系列文章證明發酵是與生命相關的現象。但是，1897年，德國著名化學家愛德華畢希納(Eduard?Buchner)成功地用不含細胞的酵母液實現發酵，說明具有發酵作用的物質存在于細胞內，并不依賴活細胞。這種物質就是酶。1926年美國人薩姆納(James?Batcheller?Sumner)首次提取出脲酶，并進行結晶，并指出酶的本質是蛋白質。

這些科學研究有力地推動了人類對酶的認識和使用。現在，已有二千余種酶被鑒定出來，其中有二百余種得到結晶。特別是近三十年來，隨著蛋白質分離技術的進步，酶的分子結構、酶作用機理的研究得到發展，有些酶的結構和作用機理已被闡明。

作為生物催化劑(biological?catalyst)，酶具有兩方面的特性。它既有與一般催化劑相同的催化性質，又具有一般催化劑所沒有的生物大分子的特征。例如，酶與一般催化劑一樣，只能催化熱力學允許的化學反應，縮短達到化學平衡的時間，而不改變平衡點。此外，酶作為催化劑在化學反應的前后沒有質和量的改變，并且微量的酶就能發揮較大的催化作用。酶和一般催化劑的作用機理都是降低反應的活化能(activation?energy)。

同時，酶作為蛋白質催化反應，又具有高度的催化效率、高度的專一性、酶活性的可調節性、酶活性的不穩定性等特點。其中，酶的前幾個特點讓人們看到了酶化學應用的光明前景，但是，酶的不穩定性卻嚴重制約了酶的進一步發展。作為蛋白質，酶催化反應要求一定的pH值、溫度等溫和的條件，強酸、強堿、有機溶劑、重金屬鹽、高溫、紫外線、劇烈震蕩等任何使蛋白質變性的理化因素都可能使酶變性而失去其催化活性。

枯草桿菌蛋白酶是一種非常重要的工業用酶。已廣泛應用洗滌劑，化妝品和不對稱催化合成。但枯草桿菌蛋白酶很不穩定。會自身水解而失活。交聯酶晶體技術是一種非常有效的酶穩定化技術。但目前尚沒有發現有關交聯枯草桿菌蛋白酶的制備方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：將提供一種工藝簡單、性能穩定的交聯枯草桿菌蛋白酶晶體的制備方法。

為解決上述問題，本發明采用的技術方案是：所述的交聯枯草桿菌蛋白酶晶體的制備方法，包括以下步驟：

(一)在4～65℃下，將質量濃度為2％～10％的枯草桿菌蛋白酶溶液和質量濃度為10％～30％的鹽溶液按體積比1∶1～1∶5的比例混合，在50～1000rpm/min的攪拌速度下，攪拌1小時～8天，溶液中有枯草桿菌蛋白酶晶體析出；

(二)在4～30℃下，將析出的晶體過濾，再經鹽溶液洗滌至少4次；

(三)將洗滌過的晶體加入鹽溶液中，攪拌1～3小時，得枯草桿菌蛋白酶晶體懸濁液；

(四)在4～45℃，300～1000rpm/min的攪拌速度下，將雙功能交聯劑慢慢加入枯草桿菌蛋白酶晶體懸濁液中，加入量為枯草桿菌蛋白酶晶體重量的1～5倍，攪拌3～16小時；

(五)將反應液經過濾或離心得交聯枯草桿菌蛋白酶晶體粗品，將得到的交聯枯草桿菌蛋白酶晶體粗品先用去離子水洗滌2～8次，再用緩沖液洗滌，直到洗滌流出液在280nm下的紫外吸收值小于0.5停止洗滌，得到所需的交聯枯草桿菌蛋白酶晶體。

在實際制作中，為便于保存，可將交聯枯草桿菌蛋白酶晶體按照重量比5％～30％的比例加入緩沖液中，攪拌1～2小時，得到交聯枯草桿菌蛋白酶晶體的懸濁液。

上述步驟(一)中的溫度優選為44～55℃，攪拌速度優選為280～320rpm/min，攪拌時間優選為3～7天。

上述步驟(一)、(二)和(三)中所述的鹽溶液為鈉或鉀的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽或磷酸二氫鹽溶液，并且優選鈉的鹽酸鹽或硫酸鹽溶液、或鉀的硫酸鹽溶液；鹽溶液濃度優選15％～20％。