[發(fā)明專利]雙基因缺失的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌減毒突變株及其構(gòu)建方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710025604.1
• 申請(qǐng)日: 2007-08-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101139567A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 焦新安;殷月蘭;潘志明;孫林;黃金林;袁舟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/87;C12N15/31
• 代理公司: 南京中新達(dá)專利代理有限公司
• 代理人: 孫鷗

1.actA、pclB雙基因缺失的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌減毒突變株構(gòu)建方法，其特征在于擴(kuò)增出待刪除基因兩翼的同源片段actA、plcB后，利用SOEing?PCR方法將其拼接在一起，插入穿梭載體pKSV7中，經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1得到的actA、pclB雙基因缺失的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌減毒突變株(Listeria?monocytogenes?yzu?LM1-2)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的actA、pclB雙基因缺失的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌減毒突變株構(gòu)建方法，其特征在于產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌actA基因同源片段的擴(kuò)增方法是：采用正義、反義引物對(duì)產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，

正義：5’CCGAATTCTTTAGTTCCGCAGTGGATGC3’

反義：5’GTCTAGCTCCAGTAGGGGATCCCTCGAGGCTGCAAATATTATG3’

回收長(zhǎng)為1000bp的actA基因同源片段。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的actA、pclB雙基因缺失的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌減毒突變株構(gòu)建方法，其特征在于產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌plcB基因同源片段的擴(kuò)增方法是：采用正義、反義引物對(duì)產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，

正義：5’CATAATATTTGCAGCCTCGAGGGATCCCCTACTGGAGCTAGA3’

反義：5’TAGTCGACCTGTTGTCATCGAAGCGCAA3’

回收長(zhǎng)為1200bp的plcB基因同源片段。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的actA、pclB雙基因缺失的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌減毒突變株構(gòu)建方法，其特征在于actA基因同源片段和plcB基因同源片段的SOEing?PCR拼接方法是，采用正義、反義引物對(duì)純化的actA基因同源片段，純化的plcB基因同源片段進(jìn)行SOEing?PCR拼接，

正義：5’CCGAATTCTTTAGTTCCGCAGTGGATGC3’

反義：5’TAGTCGACCTGTTGTCATCGAAGCGCAA3’

回收長(zhǎng)為2200bp的actA/plcB基因同源片段。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的actA、pclB雙基因缺失的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌減毒突變株構(gòu)建方法，其特征在于actA/plcB基因插入穿梭載體pKSV7的方法是：回收的actA/plcB基因同源片段用EcoRI和SalI雙酶切，同時(shí)用EcoRI和SalI雙酶切穿梭載體pKSV7，然后將actA/plcB基因同源片段與載體進(jìn)行連接反應(yīng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的actA、pclB雙基因缺失的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌減毒突變株構(gòu)建方法，重組質(zhì)粒pKSV7-actA/plcB電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌，42℃氯霉素壓力下與染色體同源重組，之后在30℃無(wú)抗生素培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)脫掉質(zhì)粒。