[發明專利]實時檢測單核苷酸多態性的熒光定量PCR方法及其試劑盒

無效

• 申請號: 200710025447.4
• 申請日: 2007-07-25
• 公開（公告）號: CN101354337A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 龍偉紅;王偉;彭早元
• 申請（專利權）人: 常州安博生物技術有限公司
• 主分類號: G01N21/00
• 分類號: G01N21/00;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1、一種實時檢測單核苷酸多態性的熒光定量PCR方法及其試劑盒，包 含以下步驟：

a、根據待檢測靶基因的特異性的序列合成一套引物探針組合，該組合 包含一對正常引物和一條探針，其中探針以該對引物之間的靶序列設計而 成；

b、根據待檢測單核苷酸位點附近特異性序列合成的一條人工分型引 物，該分型引物3’末端包含檢測位點；

c、根據待檢單核苷酸位點附近特異性序列合成另一條對應的單核苷酸 多態性PCR檢測引物，所述的引物與步驟b中包含待檢測單核苷酸位點的 人工分型引物為一對引物；

d、根據步驟b、c中兩條引物中間的特異性靶序列合成一條特異性的探 針，該探針熒光標記基團與步驟a中熒光標記基團具有不同波長；

e、使用步驟a中的引物探針組合、步驟b中的引物、步驟c中的引物 和步驟d中的探針及其他PCR反應成份組成雙重熒光PCR反應體系，其中 體系中鎂離子濃度為2～10mM，Taq酶用量為5～10單位/反應，UNG酶用 量為1～2單位/反應；

f、從待檢測物中提取DNA，或者提取RNA然后反轉錄成cDNA，加 入到e中的反應體系中去，混勻離心后放置到雙色或雙色以上熒光PCR儀 上，準備反應；

g、步驟f中的反應體系按熒光PCR反應條件經過30～50個循環結束， 每個循環的延伸過程中熒光掃描設備會收集反應過程中步驟a中合成探針 以及步驟d中合成探針的熒光增值和相對應的循環次數，并記錄下來；

h、同時用系列陽性和陰性樣品，經過步驟f中的樣品處理和PCR反應， 根據步驟g中得到的標準品的步驟a中探針的熒光增值，將該熒光增值結 合樣品的初始模板量的自然對數值做圖，并制成標準曲線；

i、用上述步驟g中獲得的各個樣品的步驟a中合成探針的熒光增值， 可以在標準曲線上查到各樣品的初始模板拷貝數；

j、上述步驟g中獲得的各個樣品的步驟a中合成探針的循環次數的Ct 值與步驟g中獲得的各個樣品的步驟d中合成探針的循環次數的Ct值的差 值，即ΔCt值，將此ΔCt值分別與野生標準品的ΔCt_w值及突變標準品的 ΔCt_M值比較，可以判斷樣品的該單核苷酸位點是否突變甚至突變基因占在 總檢測樣品中的比例。

2、按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中的兩個引物之 間相距50～500個堿基，步驟b中和步驟c中的兩個引物之間相距50～500 個堿基。

3、按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟g中所述的PCR反 應進行30～50個循環。

4、按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物、 步驟b中所述的引物和步驟c中所述的引物長度是15～28個堿基。

5、按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的探針、 步驟d中所述的探針長度是13～38個堿基。