[發明專利]錳離子診斷/測定試劑盒及錳離子濃度測定方法

無效

• 申請號: 200710023397.6
• 申請日: 2007-06-13
• 公開（公告）號: CN101324624A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/84
• 分類號: G01N33/84;G01N21/31;C12Q1/26;C12Q1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定錳離子濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。

背景技術

錳作為一種微量元素在人體中是不可或缺的必需成分，同時也是對人體有毒的物質。在自然狀態下，以兩價、三價和四價的形式存在，氧化程度越低，毒性越高。通常錳有八種不同的氧化狀態。錳的生物學意義是作為人體中輔助因子有多種多樣的功能。然而，在許多酶激活反應中，Mn²⁺和Mg²⁺可互相替代。

常用石墨爐原子吸收分光光度測定法、原子發射ICP-OES。中子激發分析(NAA)是最好的方法，但僅能在一些條件好的實驗室才能測定。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用酶循環擴增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶(偶)聯法(Couple?Reaction)技術，監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定錳離子濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的錳離子診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行錳離子濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明錳離子濃度測定方法原理如下：

草酰乙酸草酰乙酸脫羧酶/Mn²⁺丙酮酸+二氧化碳

丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸

????????????????????????????????????+水+輔酶

丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+

??????????????????????????????過氧化氫

這種方法應用需要錳離子激活的草酰乙酸脫羧酶(oxaloacetatedecarboxylase；EC?4.1.1.3)酶(偶)聯丙氨酸脫氫酶(alaninedehydrogenase；EC?1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine?oxidase；EC1.4.3.19)酶促反應連續監測法。草酰乙酸脫羧酶作為作用酶，在錳離子的激活下，功能為將草酰乙酸酶解產生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶也作為作用酶，它的酶促作用使丙酮酸變成丙氨酸。甘氨酸氧化酶作為循環酶將丙氨酸再次變回丙酮酸，使草酰乙酸脫羧酶酶解草酰乙酸產生的丙酮酸不斷地被重復循環利用。丙氨酸脫氫酶同時作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算錳離子的濃度大小。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明錳離子診斷/測定試劑盒較為理想：

緩沖液????????????????????????100mmol/L

穩定劑????????????????????????500mmol/L

還原型輔酶????????????????????0.25mmol/L

氨離子????????????????????????2mmol/L

草酰乙酸??????????????????????20mmol/L

草酰乙酸脫羧酶????????????????10000U/L

丙氨酸脫氫酶??????????????????10000U/L

甘氨酸氧化酶??????????????????10000U/L

本發明的錳離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括：

緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。

試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑：

試劑1

緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子。

試劑2

緩沖液、穩定劑、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。