[發(fā)明專利]無機(jī)磷診斷/測定試劑盒及無機(jī)磷濃度測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710023378.3
• 申請日: 2007-06-13
• 公開（公告）號: CN101324618A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王爾中
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/84
• 分類號: G01N33/84;G01N21/31;C12Q1/26;C12Q1/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種無機(jī)磷診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無機(jī)磷濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人體內(nèi)磷的87％都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態(tài)平衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35-40。當(dāng)二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，＞70時，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性鈣化。當(dāng)乘積＜35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、[Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀旁腺激素及降鈣素的調(diào)節(jié)。

由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機(jī)磷的檢測實際上是分析磷酸鹽陰離子(H₂PO₄^1-，HPO₄^2-)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結(jié)合法，酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法等。決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機(jī)磷的常規(guī)方法是比色法。

磷鉬酸還原法又有無蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩(wěn)定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合物，方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標(biāo)本空白，否則結(jié)果偏高。

酶法測定無機(jī)磷是發(fā)展趨勢，其優(yōu)點是無機(jī)磷酸鹽化合物在酶作用下的中性范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動化分析。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(EnzymaticRecycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple?Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機(jī)磷濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的無機(jī)磷診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行無機(jī)磷濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。

本發(fā)明無機(jī)磷濃度測定方法原理如下：

磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶

腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳

丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+

水+輔酶

丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+

過氧化氫

這種方法應(yīng)用丙酮酸羧化酶(Pyruvate?carboxylase；EC?6.4.1.1)酶(偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine?dehydrogenase；EC?1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine?oxidase；EC?1.4.3.19)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。丙酮酸羧化酶作為作用酶，功能為將無機(jī)磷(磷酸根)酶解產(chǎn)生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶的酶促作用使丙酮酸變成丙氨酸。甘氨酸氧化酶作為循環(huán)酶將丙氨酸再次變回丙酮酸，使丙酮酸羧化酶酶解無機(jī)磷產(chǎn)生的丙酮酸不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。丙氨酸脫氫酶同時作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算無機(jī)磷的濃度大小。

實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無機(jī)磷診斷/測定試劑盒較為理想：

緩沖液??????100mmol/L

穩(wěn)定劑??????500mmol/L

還原型輔酶??0.25mmol/L

腺苷二磷酸??5mmol/L

草酰乙酸????30mmol/L

氨離子??????30mmol/L

丙酮酸羧化酶10000U/L

丙氨酸脫氫酶12000U/L

甘氨酸氧化酶12000U/L