[發明專利]氨基酸(氮)診斷/測定試劑盒及氨基酸(氮)濃度測定方法

無效

• 申請號: 200710023359.0
• 申請日: 2007-06-13
• 公開（公告）號: CN101324585A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/31;C12Q1/26;C12Q1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種氨基酸(氮)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定氨基酸(氮)濃度的方法，屬于醫學/食品/工業/農業/環境檢驗測定技術領域。

背景技術

氨基酸含量的測定在醫學/食品/工業/農業/環境中都是比較重要的測定項目。現有的測定方法有色譜法、電化學法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計等方法，這些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設備成本較高等缺點。

氨基酸不是單純的一種物質，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價格昂貴，不能普遍使用)，對于醫學/食品/工業/農業/環境中來說，多數情況下，都是很多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。

大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、R?e?y?e綜合征、或某些因素造成蛋白質分解加速的疾病，遺傳性疾病所導致的代謝異常均可使尿中氨基酸氮增加。

酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業產品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法簡便、成本低的特點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用酶循環擴增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶(偶)聯法(Couple?Reaction)技術，監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基酸(氮)濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的氨基酸(氮)診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行氨基酸(氮)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明氨基酸(氮)濃度測定方法原理如下：

氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨離子+

過氧化氫

氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸

+水+輔酶

丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+

過氧化氫

這種方法應用氨基酸氧化酶(amino?acid?oxidase；EC?1.4.3.2；EC1.4.3.3)酶(偶)聯丙氨酸脫氫酶(alanine?dehydrogenase；EC?1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine?oxidase；EC?1.4.3.19)酶促反應連續監測法。氨基酸氧化酶作為作用酶，功能為將氨基酸酶解產生氨離子。丙氨酸脫氫酶的第一個酶促作用使氨離子產生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作為循環酶可以一再將丙氨酸再次變回氨離子，使氨離子不斷地被重復循環利用。丙氨酸脫氫酶又可作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度/速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算氨基酸(氮)的濃度大小。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明氨基酸(氮)診斷/測定試劑盒較為理想：

緩沖液????????100mmol/L

穩定劑????????500mmol/L

還原型輔酶????0.25mmol/L

丙酮酸????????10mmol/L

氨基酸氧化酶??10000U/L

丙氨酸脫氫酶??10000U/L

甘氨酸氧化酶??10000U/L

本發明的氨基酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括：

緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。

試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑：

試劑1

緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸。

試劑2

緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。