[發(fā)明專利]D－乳酸診斷/測(cè)定試劑盒及D－乳酸的濃度測(cè)定方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710023226.3
• 申請(qǐng)日: 2007-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN101324557A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王爾中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/50
• 分類號(hào): G01N33/50;G01N21/31;C12Q1/26;C12Q1/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種具有D-乳酸特異性的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定D-乳酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

L-乳酸是近年來人們十分關(guān)注并發(fā)展較快的有機(jī)酸。同時(shí)L-乳酸具有在食品、飼料、醫(yī)藥、塑料、飼料、農(nóng)藥、日用化工、造紙及電子工業(yè)等多領(lǐng)域應(yīng)用前景。

L-乳酸是大多數(shù)生物體代謝作用的終產(chǎn)物。僅少數(shù)微生物(例乳酸菌屬、明串珠菌屬)能形成D-乳酸。生產(chǎn)酸奶時(shí)非常注意檢測(cè)乳酸鹽，以評(píng)估微生物是否產(chǎn)生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，則可能是微生物造成了污染。

乳酸鹽濃度的異常升高與多種疾病如糖尿病、酸毒癥等疾病有密切的關(guān)系。L(+)-Lactate是人體中乳酸鹽代謝的主要中間產(chǎn)物，并且存在于血液中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5％。

血乳酸測(cè)試作為一個(gè)監(jiān)護(hù)、監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練能力的手段，把血乳酸值作為衡量運(yùn)動(dòng)員有氧耐力水平、無氧訓(xùn)練能力、身體疲勞恢復(fù)等方面的一個(gè)重要數(shù)據(jù)，供安排訓(xùn)練時(shí)參考。

酶法分析是國際上公認(rèn)的分析方法，已被多個(gè)國際權(quán)威組織或機(jī)構(gòu)采納：如IFU(國際果汁生產(chǎn)者協(xié)會(huì))，AIJN(歐盟果蔬汁及飲料生產(chǎn)者聯(lián)盟)，及MEBAK，OICC，VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提出一種利用具有D-乳酸特異性的酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple?Reaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測(cè)定D-乳酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行D-乳酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。

本發(fā)明D-乳酸濃度測(cè)定方法原理如下：

D-乳酸+2高鐵細(xì)胞色素c?????D-乳酸脫氫酶????丙酮酸+

??????????????????????????????????????????2來鐵細(xì)胞色素c

丙酮酸+輔酶A+輔酶???????丙酮酸脫氫酶????二氧化碳+

????????????????????????????????乙酰輔酶A+還原型輔酶

這種方法應(yīng)用具有D-乳酸特異性的D-乳酸脫氫酶(D-Lactatedehydrogenases；EC?1.1.2.4；EC?1.1.2.5)偶聯(lián)丙酮酸脫氫酶(pyruvatedehydrogenase；EC?1.2.1.51)酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。D-乳酸脫氫酶酶解D-乳酸反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，再通過偶聯(lián)丙酮酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測(cè)量340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測(cè)算D-乳酸的濃度大小。

實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒較為理想：

緩沖液???????????100mmol/L

穩(wěn)定劑???????????500mmol/L

輔酶?????????????3mmol/L

輔酶A????????????5mmol/L

2高鐵細(xì)胞色素c???10mmol/L

D-乳酸脫氫酶?????12000U/L

丙酮酸脫氫酶?????12000U/L

本發(fā)明的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括：

緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A、2高鐵細(xì)胞色素c、D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶。

試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑：

試劑1

緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A、2高鐵細(xì)胞色素c。

試劑2

緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶。