[發明專利]甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的制備及該抗體用于同源或異源酶聯免疫分析的方法

無效

• 申請號: 200710022047.8
• 申請日: 2007-04-27
• 公開（公告）號: CN101066998A
• 公開（公告）日: 2007-11-07
• 發明（設計）人: 金征宇;彭池方;胥傳來;謝正軍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/535
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的制備及該抗體用于同源或異源酶聯免疫分析的方法，本發明涉及一種特異性好、靈敏度高的甲羥孕酮醋酸酯的ELISA分析方法的建立，屬于酶聯免疫分析技術領域。

背景技術

甲羥孕酮醋酸酯(Medroxyprogesterone?acetate，MPA)是一種合成的甾體類孕激素。在人體的藥物應用中，被用作激素替代治療中的避孕藥和激素依賴性腫瘤的治療。在獸藥應用中，可用于動物治療和飼養促生長。由于不當使用和非法使用，使得動物食品中殘留過量的MPA，可對人體生殖產生抑制作用，尤其是對兒童的健康產生潛在威脅，可能會產生各種慢性和積蓄性毒性，如“三致作用”(致癌、致畸、致突變)。

由于甲羥孕酮醋酸酯具有顯著的同化作用，可顯著促進動物生長，在美國、澳大利亞、新西蘭已批準用于動物飼料添加劑，但有嚴格的停藥期。我國和歐盟禁止其用作飼料添加劑，但仍有非法使用。為了保障我國動物食品消費者的健康和安全，加強對甲羥孕酮醋酸酯的分析監測非常必要的。

測定食品和環境中甲羥孕酮醋酸酯殘留的方法主要有高效液相色譜法、色譜-質譜聯用以及免疫分析法。其中酶聯免疫分析法(ELISA)特異性好、成本低、樣品通量高，在食品安全監測中具有非常重要的作用。但尋求操作簡便、靈敏度高、特異性高的酶聯免疫分析法(ELISA)一直是科研工作者的研究方向。

目前，國內外對甲羥孕酮醋酸酯殘留的ELISA方法研究較少，新型抗體和ELISA方法的建立為甲羥孕酮醋酸酯殘留分析提供了一個有力的手段。

發明內容

本發明的目的是提供一種甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的制備方法，同時提供其同源或異源酶聯免疫分析方法。

本發明地技術方案：

一種甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的制備方法，其步驟為：

1)人工半抗原的合成：以甲羥孕酮醋酸酯、氯地孕酮醋酸酯或甲地孕酮醋酸酯為原料，其與羧甲基氧胺鹽酸鹽的投料摩爾比為1∶1.2～1∶1.5，在甲醇中溶解甲羥孕酮醋酸酯、氯地孕酮醋酸酯或甲地孕酮醋酸酯，將羧甲基氧胺鹽酸鹽和適量的乙酸鈉溶于其中，使pH為5～7，室溫下攪拌24小時。減壓蒸餾去除甲醇后，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取殘余物，經Na₂SO₄干燥，過濾，蒸餾去除乙酸乙酯，干燥得到白色固體為3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-20-酮醋酸酯(3-CMO-MPA)、3-羧甲基肟基-6-氯-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-CMA)或3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-MEGA)；

2)人工抗原的合成：

a免疫原的合成與純化

免疫原采用碳二亞胺法合成，將50μmol半抗原3-CMO-MPA加入到1mL的N，N-二甲基甲酰胺中溶解，加入50μmol的二環己基碳二亞胺和50μmol的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應過夜，離心，取上清溶液100～800μl緩慢加入到4mL10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)硼酸緩沖溶液中，攪拌反應1小時，然后透析袋中對0.01mol/L磷酸緩沖液透析，分裝保存于-20℃；

b包被抗原的合成與純化

包被抗原采用混合酸酐法合成，將50μmol半抗原3-CMO-MPA、3-CMO-CMA或3-CMO-MEGA加入到1mL的N，N-二甲基甲酰胺中溶解，加入50μmol的三丁胺和50μmol氯甲酸異丁酯，4℃下反應1小時，將反應液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸緩沖溶液中，攪拌反應2小時。轉入透析袋，然后透析袋中對0.01mol/L磷酸緩沖液和純水透析，分裝保存于-40℃；

3)抗體的制備：

a免疫動物血清的制備

選用三月齡、體重2kg雌性新西蘭白兔，將3-CMO-MPA免疫原免疫三只，免疫劑量為0.5～1.5mg免疫原/次·只，初次免疫，免疫原中加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中不分散，兔背部皮下多點注射免疫原，3～4周后，進行加強免疫，以后2～3周進行加強免疫，加強免疫時采用弗氏不完全佐劑，待血清質量合格后，采用心臟取血法采血，收集在試管中的血液凝固后，然后放置在37℃溫箱中半小時，再放到4℃冰箱中過夜，待血塊收縮后，5000rpm離心15min，分離出血清；

b血清的純化