[發明專利]一種重組戊型肝炎病毒蛋白、其制備方法及用途

無效

• 申請號: 200710021746.0
• 申請日: 2007-04-27
• 公開（公告）號: CN101062941A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 孟繼鴻;戴星;董晨
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C07K14/005
• 分類號: C07K14/005;C12N15/51;G01N33/68;G01N33/576;C12Q1/68;A61K39/29;A61P1/16
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 陸志斌

一、技術領域

本發明屬于分子生物學及醫學領域，特別涉及一種重組戊型肝炎病毒蛋白、其制備方法及用途。

二、背景技術

現有技術：戊型肝炎病毒(hepatitis?E?virus，HEV)是引起東南亞、中亞以及非洲等地急性傳染性肝炎的主要病原體。HEV主要經過糞-口途徑傳播，通常是飲用受污染的水源引起，HEV引起的戊肝流行方式主要有暴發流行和散發兩種。HEV的感染可以累及不同年齡的患者，但感染多見于成年人。一般來說，戊肝和甲肝的臨床癥狀相似，目前的研究認為，在一些發展中國家HEV的感染率已經超過甲肝的感染率，而且病情也更為嚴重，研究顯示在各類肝炎中，戊肝的病死率最高，尤其是在孕婦患者中，死亡率甚至超過20％。

作為發展中國家，我國HEV的感染情況同樣值得重視。1986～1988年我國新疆南部地區曾發生HEV水型流行，共計發病119280例，死亡707例，是迄今為止世界上最大的一次戊肝流行。有學者對我國17個城市2548例急性散發型病毒性肝炎的血清學調查研究發現，戊肝占3.4～26.3％，平均為9.7％。而我們近來對全國10個省市及華東部分地區大規模人群的的調查研究發現，HEV?IgG抗體的陽性率分別約為18％和17％。此外，衛生部的統計報告也表明，我國HEV的流行方式主要呈散發和小規模暴發兩種形式，每年均有十數起小規模HEV的暴發流行，而且發病人數呈逐年上升趨勢。其中2004年我國戊肝的發病人數幾乎為2003年的兩倍。由于目前尚缺乏特異性的治療方法，因此控制HEV的傳播和流行的手段主要是通過研制特異性的戊肝疫苗加以預防。

由于HEV缺乏有效的細胞培養系統，無法制備減毒疫苗或滅活疫苗，國內外研究多集中于基因工程重組戊肝疫苗的研制，因此采用合適的表達系統表達含有HEV中和抗原表位的重組HEV蛋白，對于研制有效的戊肝疫苗極為重要。盡管目前已有學者采用真核和原核表達系統成功制備了一些重組HEV蛋白，但是，由于采用真核表達系統費時費力費錢，采用原核表達系統時產物均以包涵體形式存在，需要經歷變性和復性的過程，容易影響重組蛋白的天然構象，并造成產量的降低。因此，眾多學者一直致力于采用原核表達系統表達天然可溶的重組HEV蛋白。然而，迄今為止仍無成功研制的報道。

三、發明內容

本發明針對上述技術問題，提供一種方便易行、低成本并具有良好的抗原性和免疫原性的重組戊型肝炎病毒蛋白、其制備方法及用途。

本發明的技術解決方案為：提供一種分離的重組戊型肝炎病毒多肽，它選自下組：a.具有SEQ?ID?NO：2氨基酸序列的多肽；b.將SEQ?ID?NO：2氨基酸序列經過一個或數個氨基酸殘基的缺失、插入或取代形成的，且具有能夠誘導高滴度的、特異性的HEV中和抗體產生的由a衍生的多肽。提供一種多肽，該多肽是具有具有SEQ?ID?NO：2氨基酸序列的多肽。提供一種分離的多核苷酸，選自下組：a.編碼上述氨基酸序列多肽的多核苷酸；b.與多核苷酸a完全互補的多核苷酸。提供一種多核苷酸，該多核苷酸編碼具有SEQ?ID?NO：2所示氨基酸序列的多肽。提供上述多核苷酸的載體。一種遺傳工程化的宿主細胞，其含有上述載體。一種重組戊型肝炎病毒多肽的制備方法，該方法包括：a.在適合表達重組戊型肝炎病毒多肽的條件下，培養所述的宿主細胞；b.從培養物中分離出重組戊型肝炎病毒多肽。一種診斷試劑或疫苗，它含有安全有效劑量的所述的多肽或所述的多核苷酸或所述的載體，以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。

本發明所述的一種新型重組HEV蛋白，含有179個氨基酸(HEVp179)。其氨基末端位于開放閱讀框架2編碼衣殼蛋白的380位至480位氨基酸之間，羧基末端位于580位至650位氨基酸之間或由此蛋白片段產生的衍生物，優選片段是戊型肝炎病毒第4基因型毒株開放讀碼框架2中編碼中和抗原表位的位于第453位至631位氨基酸序列的基因片段。該重組HEV蛋白的特征在于含有戊型肝炎病毒的中和抗原表位，其編碼的基因片段能夠在原核表達系統中高效、可溶性表達，經過純化后可以形成戊型肝炎病毒樣顆粒(Hepatitis?E?viruslike?paticles，HEV?p179-VLPs)。

本發明所述重組HEV蛋白的制備方法方法：將編碼HEV中和抗原表位的優選基因片段與質粒pET-28a(+)或經改造的質粒pET-28a(+)進行重組，再將該重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG的誘導下進行表達。上述優選基因片段的核苷酸序列為：