[發明專利]重組人中期因子(rh－Midkine)的表達及其單克隆抗體的制備和應用

無效

• 申請號: 200710021657.6
• 申請日: 2007-04-23
• 公開（公告）號: CN101294164A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發明（設計）人: 侯亞義;趙樹立;王慶苓;黃亞紅;王會;謝浩
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/12;C12N1/21;C12P21/02;C07K19/00;C07K16/18;C12N5/18;A61K39/395;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/49;G01N33/493;A61P35/00
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技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及人中期因子MK的原核表達、單克隆抗體的制備及其應用。?

背景技術

1988年日本學者Kadomatsu等在視黃酸誘導的小鼠胚胎腫瘤細胞系HM1細胞cDNA文庫中發現Midkine(MK)基因，中文稱為中期因子。早期研究發現中期因子是一種對細胞的生長和分化起重要作用的細胞因子。它能促進正常細胞的生長和分化，尤其可促進神經細胞的發育。近年對人腫瘤研究發現，MK具有誘導細胞轉化、促有絲分裂、生血管、抗細胞凋亡和增強纖維蛋白溶解等與腫瘤發生與發展密切相關的生物學功能，且在多種腫瘤組織中均有異常表達。?

Konishi等對15例潛伏期前列腺腫瘤、16例PIN(膀胱上皮內瘤形成)及正常前列腺組織進行了免疫組化分析研究顯示，80％潛伏期腫瘤和75％PIN有MK高度表達，而正常組織不表達或僅微弱表達MK。在結直腸癌的早期發生中，伴中度或重度發育異常的腺瘤，MK表達均明顯高于輕度異常或正常組織。?

本實驗室通過RT-PCR和免疫組化的方法，檢測9例正常胃鏡組織、37例胃腫瘤組織及其相應的配對癌旁組織中MK的表達情況，對MK的表達進行定性、定量和定位分析，并進一步分析了MK表達水平與腫瘤臨床病理之間的關系。RT—PCR定性分析表明，MK在胃癌組織中高表達(表達率為94.6％)，癌與癌旁MK表達有顯著差異，而且癌與正常組織有顯著差異；RT-PCR定量分析結果證實了定性分析的結果，而且發現MK的表達與腫瘤的臨床分期及遠處轉移情況相關，而與腫瘤的組織分化、大小及淋巴結轉移情況無關；免疫組化定位分析發現，MK蛋白廣泛存在于腫瘤細胞的細胞質，此外，細胞核和核仁也有MK聚集，細胞外組織中腺泡處MK表達尤為明顯。?

國內外的研究結果均表明：MK與腫瘤的發生與發展密切相關，MK的表達與腫瘤發展的進程及嚴重程度也密切相關。而且由于MK在腫瘤形成的早期就有異常表達，MK檢測將有可能應用于腫瘤的早期診斷。?

由于目前尚缺乏特異性強的MK單克隆抗體檢測和靶向治療腫瘤的MK單克隆抗體藥物，臨床上對MK的免疫學檢測都是用多克隆抗體，在檢測過程中存在交叉反應、特異性低等不可避免的缺點。正是因為沒有特異性高的人MK單克隆抗體，所以對MK的檢測特別是血液、尿液中MK的檢測受到了相當大?的限制。本發明得到了一株特異性高的單克隆抗體，證明本發明可以用于腫瘤組織、血液、尿液中MK的特異性檢測。并可以通過特異性結合MK而靶向作用于富含MK蛋白的腫瘤細胞。?

發明內容

本發明的目的是提供一種特異性抗MK蛋白的單克隆抗體。?

本發明的另一個目的是提供一種特異性檢測腫瘤病人血液、尿液和組織的檢測試劑盒。?

本發明的另一個目的是提供一種能靶向作用于富含MK蛋白的腫瘤細胞的單克隆抗體偶聯物。作為靶向富含MK蛋白腫瘤細胞的治療劑。?

在本發明的第一個方面，提供了一種免疫球蛋白IgG1，其特征在于，它能特異性結合MK蛋白，所述MK蛋白具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。?

在本發明的一個實例中，所述的免疫球蛋白是單克隆抗體。?

在本發明的另一個實例中，所述的免疫球蛋白由小鼠雜交瘤細胞系9E10所產生，這種免疫球蛋白還包括人源化改造的MK單克隆抗體。?

本發明的第二個方面，提供了能檢測腫瘤組織中的MK蛋白含量的試劑盒，它含有上述免疫球蛋白或與這種免疫球蛋白形成的偶聯物，其特征是該免疫球蛋白偶聯物具有特異性結合MK蛋白的免疫球蛋白或活性片段及可以將藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、酶、熒光素、納米材料分別偶聯到免疫球蛋白或活性片段上的偶聯物。?

本發明的第三方面，提供了上述免疫球蛋白或免疫球蛋白偶聯物作為一種藥物組合物，其特征是可靶向作用于富含MK蛋白的腫瘤組織。?

附圖說明

圖1顯示的是經過表達、純化的30P-MK的蛋白電泳分析。表明30P-MK為可溶性分泌表達，而且便于純化。加樣孔1指的是蛋白Marker，圖左邊標記的數字是對應條帶的分子量；加樣孔2是指未經過誘導的總蛋白上樣，加樣孔3是經過低溫誘導的總蛋白上樣，可以明顯看出在17KD左右有明顯的蛋白表達；加樣孔4是指經過用1.2M洗脫液洗脫的蛋白電泳分析，可以看出還有一些少量雜蛋白；加樣孔5是2M洗脫液的蛋白電泳分析，得到完全純化的蛋白。?