[發明專利]人源化改造的鼠ING4基因及其腺病毒表達載體

有效

• 申請號: 200710021174.6
• 申請日: 2007-04-02
• 公開（公告）號: CN101058809A
• 公開（公告）日: 2007-10-24
• 發明（設計）人: 楊吉成;張海峰
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/47;C12N15/861;C12N1/21;A61K48/00;A61K35/74;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司
• 代理人: 王荷英

技術領域

本發明屬于生物技術和醫學領域，具體地說，本發明涉及人源化改造的鼠ING4(腫瘤生長抑制因子4)基因和經去GFP載體改造后的ING4重組腺病毒載體，含有該基因的重組載體和宿主細胞。本發明還涉及本發明的基因、重組載體和宿主細胞的制備方法和用途。

背景技術

腫瘤是當今社會影響人類健康的主要疾病之一。近代細胞生物學研究表明，體內細胞在增殖、分化和凋亡的過程中，受到體內正性和負性兩類調控信號的調節。正性信號(癌基因、生長因子)與負性信號(腫瘤抑制基因、生長抑制因子)之間平衡的破壞會導致腫瘤的發生。腫瘤的發生發展受體內多種基因的調控。腫瘤抑制基因正是參與這一調控的重要分子，很多腫瘤中都有某些腫瘤抑制基因失活。向缺失某種抑癌基因的細胞內導入正常的抑癌基因，則可逆轉腫瘤細胞的表型、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡，以達到治療目的。

生長抑制基因家族(ING)成員，最早發現有ING1、ING2和ING3，其中ING1及ING2能以P53依賴的方式抑制細胞增殖，誘導細胞G1期阻滯及細胞凋亡(參見，如I.Garkavtsev等人，Nature?391(1998)295-298；C.C.Helbing等人，Cancer?Res.57(1997)1255-1258；以及M.Nagashima等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA?98(2001)9671-9676)。ING3能增強P53下游基因表達，如P21及Bax等(參見M.Gunduz等人，Oncogene?21(2002)4462-4470)。

2004年又發現ING4(參見R.M.Hu，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA?97(2000)9543-9548)，ING4基因位于染色體12p13.31，至少有8個外顯子。生物信息學分析顯示ING4有一個PHD(plant?homeodomain)鋅指區和核定位信號(NLS)區。

ING4在多數腫瘤中有缺失突變，Mehmet?Gunduz等根據ING4周圍6個微衛星標志(D12S372，D12S77，D12S1697，D12S89，D12S825，D12S391)，發現在50例腫瘤樣品中，66％腫瘤組織樣品有D12S825標記的改變，它離ING4基因僅700bp(參見M?Gunduz等人，Gene356(2005)109-117)。另外發現在一些細胞中有465位C，446位A單核苷酸的缺失，而導致了移碼突變，并提前產生了終止密碼，從而使表達的ING4缺失了一半的氨基酸，其中包括PHD鋅指結構缺失(參見S?Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA?101(2004)16251-16256)。有研究顯示ING4穩定表達可使體外培養的肝癌細胞系(HepG2)G2/M期增加，同時細胞凋亡增加了20％，將過表達ING4的HepG2細胞接種到裸鼠體內，其生長速度明顯減慢。此外，研究表明ING4還能增強了HepG2對化療藥物的敏感性，如阿霉素(DOX)和鬼臼乙叉甙(ETO)(參見Xin?Zhang等人，FEBS?Letters，570(2004)，7-12)。

Masaynki?shi?seki等發現ING4在體內能與p53結合，并能提高P53382位賴氨酸的乙酰化程度，進而提高P53下游基因如P21、BAX等的表達，但P53本身的表達無明顯改變(參見Masayuki?S等人，Cancer?research，63(2003)，2373-2378)。zhang?xin等人通過表達了一系列GST-ING4不同區域的融合蛋白，進行了GST結合實驗(pull?down)，進一步證實ING4的核定位信號在與p53結合中起關鍵作用(參見Xin?Zhang等人，Biochemical?andBiophysical?Research?Communications?331(2005)1032-1038)。