[發(fā)明專利]家豬B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710020916.3
• 申請日: 2007-04-03
• 公開（公告）號: CN101089179A
• 公開（公告）日: 2007-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張雙全;管政兵
• 申請（專利權(quán)）人: 南京師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/47;A61K38/17;A61P37/00
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及家豬B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA及其克隆、表達(dá)技術(shù)。

背景技術(shù)

人B淋巴細(xì)胞刺激因子(hBAFF)是1999年新發(fā)現(xiàn)的一種與人體免疫調(diào)控密切相關(guān)的腫瘤壞死因子家族成員，主要在外周血單核細(xì)胞、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中表達(dá)。BAFF具有很強(qiáng)的B細(xì)胞趨化性，體外它作為B細(xì)胞增殖和分化的共刺激因子，能誘導(dǎo)活化的B細(xì)胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等，對于休眠B細(xì)胞，BAFF雖不能獨(dú)立激活使之進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)，但通過上調(diào)細(xì)胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-X_L的表達(dá)，延長休眠B細(xì)胞的壽命。體內(nèi)它可以促進(jìn)脾臟內(nèi)T1-B細(xì)胞向T2-B細(xì)胞以及成熟B細(xì)胞的發(fā)育。BAFF的正常表達(dá)是GC形成、抗體親和力成熟、記憶性B細(xì)胞形成及B細(xì)胞正常發(fā)育的必須條件。BAFF-/-小鼠的次級淋巴器官囊外及過渡區(qū)B細(xì)胞完全缺失。BAFF刺激B細(xì)胞增殖、分化并分泌抗體，成熟的B細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗體構(gòu)成了機(jī)體抵御感染和抑制腫瘤滋生的關(guān)鍵組分。由于BAFF的免疫增強(qiáng)特異活性，自從被發(fā)現(xiàn)以來就顯示了巨大的臨床應(yīng)用前景。2000年11月，美國FDA已正式批準(zhǔn)重組人BAFF進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)，用于治療普通變異免疫缺乏癥(CVID)患者。

根據(jù)GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果得知，目前只有人、鼠、雞、鴨和鵝的BAFF?cDNA已被克隆，并分別已在GenBank數(shù)據(jù)庫中申請了序列號，序列號分別是AF116456、AF119383、AF506010、DQ445092及DQ874394。家豬B淋巴細(xì)胞刺激因子(pBAFF)cDNA還未被克隆出來，關(guān)于家豬BAFF基因的研究及應(yīng)用在整個國內(nèi)外還處于完全空白狀態(tài)。家豬是國內(nèi)外十分重要的肉源畜類，由于B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)具有很強(qiáng)的免疫增強(qiáng)能力，基因工程家豬BAFF蛋白有可能開發(fā)成一種能增強(qiáng)家豬免疫能力的生物制劑(如免疫佐劑等)，用于體質(zhì)弱、免疫功能低下的病家豬，增加家豬的抗病毒能力，尤其是在由于家豬新型免疫抑制性疾病如家豬藍(lán)耳病、偽狂犬，圓環(huán)病毒病(仔家豬斷奶多系統(tǒng)消耗性綜合癥)，導(dǎo)致傳統(tǒng)獸醫(yī)疫苗免疫效力不足或失效，因而給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了極大損失的今天。近年來，隨著對細(xì)胞因子研究的不斷深入和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量家豬的細(xì)胞因子得以克隆及重組表達(dá)，許多細(xì)胞因子基因工程藥物面市。細(xì)胞因子用于細(xì)菌病毒類疾病的治療能夠克服傳統(tǒng)藥物副作用大、療效不佳的缺點(diǎn)，而且運(yùn)用基因工程方法生產(chǎn)的細(xì)胞因子，可以大大降低生產(chǎn)成本，獲得良好的市場信價比，因此，重組家豬BAFF(pBAFF)蛋白具有潛在的巨大市場應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從家豬提取的B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)cDNA，并提供B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA的克隆方法及重組表達(dá)及活性檢測技術(shù)。

本發(fā)明從家豬中克隆到B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA，它具有SEQ?ID?NO.1所示的序列。

家豬B淋巴細(xì)胞刺激因子，它具有SEQ?ID?NO.2所示的序列。

本發(fā)明的家豬B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA的克隆方法如下：

(1)根據(jù)已知物種的B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA保守序列設(shè)計引物：

正義寡核苷酸兼并引物z1：5’-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3’(N＝A、T、G、C)

反義寡核苷酸兼并引物z2：5’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’(N＝A、T、G、C)

(2)從家豬脾臟提取總RNA。

(3)通過RT-PCR方法，以上述引物z1及z2為特異性引物，擴(kuò)增出一段cDNA序列，命名為P1，克隆入pMD18-T載體，并對其堿基序列進(jìn)行測定。

(4)應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法，根據(jù)已獲得的P1核苷酸序列設(shè)計正義引物GSP2(5’-GAACTGAGTCTGGTGACTTTGTTCCGA-3’)及反義引物GSP1(5’-CTCCTTCCTCCAGCTTTGCAATGCCAGC-3’)分別用以擴(kuò)增出BAFF?cDNA?3’-及5’-全長末端區(qū)域，擴(kuò)增片段分別命名為P2及P3，然后分別克隆入pMD18-T載體，對其堿基序列進(jìn)行測定。